【摘要】：目的:探讨凉血通瘀方治疗急性脑出血的抗炎机制以及对肠道菌群的影响。方法:采用改良自体血注入法建立脑出血大鼠模型,造模成功后,随机分为假手术组、模型组、凉血通瘀组,于24h、72h、120h三个时间点观察。从行为学、脑组织含水量、血脑屏障通透性和脑血肿含量方面观察凉血通瘀方对脑出血大鼠脑损害指标的影响;从排便作用、肠道平滑肌收缩力方面观察对肠道动力指标的影响;Western blot检测脑出血大鼠脑组织NF-κB蛋白表达,ELISA法检测脑组织TNF-α、IL-1β表达,研究对炎性因子的影响;免疫组织化学、ELISA检测大鼠脑、肠组织CCK-8表达,Western blot检测肠组织NF-κB蛋白表达,脑组织PKA、P38MAPK、IκκB蛋白表达,阐明本方治疗脑出血的抗炎机制;对脑出血大鼠粪便样本进行miseq文库制备,采用Illumina Miseq 2x300 bp高通量测序及生物信息学分析,解析凉血通瘀方对脑出血大鼠肠道菌群的影响。结果:1(1)行为学评分:凉血通瘀组在脑出血72h、120h神经功能明显改善,缺损评分低于模型组(P0.05,P0.01),凉血通瘀方可改善脑出血大鼠神经功能缺损;(2)脑组织血肿含量:凉血通瘀组72h脑血肿含量(21.71±7.31)μl,显著低于模型组(27.52±6.43)μl;120h 凉血通瘀组(16.53±6.28)μl,显著低于模型组(24.17±7.21)μ1(P0.01),提示可以明显促进血肿吸收;(3)脑组织含水量:凉血通瘀组在72h、120h脑组织含水量显著下降(P均0.01),120h含水量接近手术组,说明可显著降低脑组织含水量,减轻脑水肿;(4)血脑屏障通透性:凉血通瘀组各时间点EB含量显著下降(P均0.01),120hEB含量和假手术组无统计学差异,提示可明显改善脑出血后血脑屏障通透性。2(1)排便作用观察:模型组粪便多质硬或成形,凉血通瘀组粪便多成形或稀软,凉血通瘀组黑便百分比显著高于模型组(P0.01),揭示本方可增强胃肠动力,促进大便排出;(2)肠道平滑肌收缩力:模型组肠道活力值最低,凉血通瘀方治疗后肠道收缩频率、收缩振幅、肠道活力值明显升高(P0.05,P0.01),揭示脑出血可导致肠蠕动减慢,肠道收缩力下降,而经凉血通瘀方治疗后可加快肠道蠕动,促进肠道平滑肌收缩。3(1)脑组织NF-κB P65蛋白表达:脑出血24h模型组、凉血通瘀组脑组织p-NF-κB p65蛋白表达升高(P0.01,P0.05),72h凉血通瘀组与假手术组相比无统计学差异(P0.05),120h凉血通瘀组显著低于模型组(P0.01),说明凉血通瘀方可降低p-NF-KB p65蛋白表达,拮抗脑出血后炎性反应;(2)脑组织TNF-α、IL-1β表达:各时间点凉血通瘀组TNF-α、IL-1β含量低于模型组(P0.05,P0.01),说明可降低TNF-α、IL-1β表达,发挥抗炎作用。4(1)血肿周围脑组织CCK-8表达:各组大鼠24hCCK-8表达无统计学差异,72h、120h凉血通瘀组脑组织CCK-8表达高于高于模型组(P0.05,P0.01),揭示凉血通瘀方可逐渐增加脑组织CCK-8表达;(2)肠组织CCK-8表达:各组大鼠24h、72h凉血通瘀组肠组织CCK-8表达高于假手术组、模型组(P0.01,P0.05),120h各组肠组织CCK-8表达无统计学差异,揭示脑出血后肠组织CCK-8表达立即升高,72h后逐渐下降,凉血通瘀方可迅速增加肠组织CCK-8表达;(3)肠组织NF-1κBP65蛋白表达:各时间点凉血通瘀组肠组织p-NF-κB P65蛋白表达显著低于模型组(P均0.01),说明可拮抗脑出血后肠道炎性反应;(4)脑组织PKA蛋白表达:24h模型组、凉血通瘀组PKA蛋白表达显著高于正常组、假手术组(P均0.01);72h、120h凉血通瘀组PKA蛋白表达显著高于模型组(P0.01),揭示凉血通瘀方治疗脑出血72h、120h脑组织PKA蛋白表达明显升高,与脑组织CCK-8变化趋势一致;(5)脑组织P38MAPK蛋白表达:24h模型组P38MAPK蛋白表达显著高于正常组、假手术组(P均0.01),而模型组和凉血通瘀组无明显差异;72h、120h凉血通瘀组P38MAPK蛋白表达低于模型组(P均0.05),揭示治疗脑出血后脑组织P38MAPK蛋白表达明显降低,与脑组织CCK-8变化趋势相反;(6)脑组织IκB蛋白表达:24h、72h模型组、凉血通瘀组IκB蛋白表达均降低,无明显差异;120h凉血通瘀组IκB蛋白表达显著高于模型组(P0.01),与正常组基本一致,揭示本方治疗脑出血后IκB蛋表达逐渐升高,抑制IκB降解,与脑组织NF-κB变化趋势基本一致。5(1)Alpha多样性分析:Chao指数、Ace指数、Shannon指数、Simpson指数和丰度等级图曲线显示假手术组5d、凉血通瘀组5d和凉血通瘀组1d大鼠肠道微生物物种丰富度和均匀度最高,模型组3d、假手术组1d和模型组1d物种丰富度和均匀度最低,说明脑出血可引起肠道微生物丰富度下降、微生物分布紊乱,而经凉血通瘀方治疗后可恢复肠道微生物菌群丰富度,促使肠道微生物分布均匀;(2)基于物种信息分析各组样本的菌落结构:以肠道微生物门水平物种结果为例,假手术组1d以拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门为主,第3d、5d拟杆菌门逐渐减少,厚壁菌门逐渐增多;模型组1d拟杆菌门明显低于假手术组,厚壁菌门高于假手术组,第3d、5d拟杆菌门逐渐增多,厚壁菌门逐渐减少;凉血通瘀组1d拟杆菌门低于假手术组组,但高于模型组;随时间推移第3d、5d拟杆菌门逐渐减少,厚壁菌门逐渐增多,变化趋势类似于假手术组,揭示本方治疗脑出血后拟杆菌门逐渐减少,厚壁菌门逐渐增多,类似于假手术组变化,可恢复肠道微生物菌群正常构成;(3)Beta多样性分析:门水平样品聚类树与柱状图组合分析图结果显示凉血通瘀组3d、5d拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门等分布类似;假手术组3d、5d拟杆菌门、厚壁菌门等分布类似,与凉血通瘀组3d、5d类似;凉血通瘀组3d、5d与假手术组3d、5d门水平分布类似,与模型组1d、3d、5d、假手术组1d差异性大,揭示凉血通瘀方治疗脑出血大鼠后肠道微生物门水平类似假手术组分布,可恢复肠道微生物菌群正常构成。结论:凉血通瘀方可抑制NF-κB、IL-1β、TNF-α等炎性因子水平表达,减轻脑出血炎性反应,从而促进血肿吸收,减轻脑出血大鼠脑水肿,改善血脑屏障通透性,改善脑出血大鼠的神经功能;凉血通瘀方促进肠道蠕动,促进肠道平滑肌收缩,依次升高肠组织、脑组织CCK-8含量,脑组织CCK-8通过升高PKA、IκB蛋白表达,降低P38MAPK蛋白表达,抑制脑组织NF-κB p65蛋白表达,调节脑肠互动,发挥抗炎作用;脑出血后肠道微生物丰富度下降、微生物分布紊乱,凉血通瘀方治疗后可恢复肠道微生物菌群丰富度,促使肠道微生物分布均匀,拟杆菌逐渐减少,厚壁菌逐渐增多,恢复肠道菌群的正常构成。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5
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本文编号：
2419239
