GNAQ和MPP8及其信号通路在胃癌发生发展中的作用和机制研究

发布时间：2019-03-22 13:05

【摘要】：目的:以术后胃癌患者组织标本、人胃癌细胞系为研究对象,探讨GNAQ和MPP8与胃癌患者预后与临床病理特征之间的关系,探讨GNAQ和MPP8及其相关通路在胃癌发生发展中的作用和分子机制。方法:1.通过免疫组化检测术后胃癌患者大体组织标本中癌组织和癌旁正常组织GNAQ和MPP8的表达情况,并比较GNAQ、MPP8表达情况与患者预后和临床特征的关系。2.建立稳定敲减MPP8的人胃癌细胞MGC803,建立稳定敲减MPP8的人胃癌细胞MGC803,与胃癌细胞MGC803一起作为研究对象。3.通过MTT法及克隆形成实验检测细胞生存活性的变化。4.通过Annexin V/VAAD双染应用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。5.通过流式细胞术进行细胞周期的检测。6.通过细胞迁移和侵袭实验检测细胞的迁移及侵袭能力。7.通过Western blot方法检测细胞下游相关通路蛋白的表达变化。结果:第一部分1.GNAQ在胃癌术后患者的癌组织中表达明显高于癌旁正常组织(76%vs.51%,p0.001***)。GNAQ与胃癌患者不同临床特征进行比较,结果显示:GNAQ在年龄60岁患者中的表达明显低于≥60岁患者(68.3%vs.88.5%,p0.001***),在低分化患者的表达明显高于中分化患者(87.5%vs.69%,p0.001***),在有辅助治疗患者明显低于无辅助治疗患者(67.7%vs.83.4%,p0.01**),然而对于不同性别、不同分期及不同肿瘤位置来说,GNAQ表达无统计学差异。2.GNAQ在癌组织中的表达情况与胃癌患者预后无明显相关性。GNAQ在癌组织中阳性表达与GNAQ阴性表达的患者3年DFS率分别是69.8%和63%(log-rank p=0.496),无统计学差异;3年OS率分别是65.4%和59.1%(log-rank p=0.430)。不同临床病理特征的亚组分析结果也得到相似结论。为了进一步分析GNAQ在胃癌患者中表达情况与预后的关系,DFS及OS的单因素及多因素COX回归分析结果显示:分期和分化程度可以作为胃癌的独立预后因素,而其他特征不能够作为胃癌的独立预后因素。3.敲减GNAQ后胃癌细胞MGC803生长受限。监测了5天细胞的增殖活力情况。从第2天开始,随着时间的延长,可见MGC803细胞在感染了Lv-sh GNAQ后细胞数逐渐低于Con和sh Con组;在第5天时更为明显,Lv-sh GNAQ组的细胞数目分别为sh Con的35%左右,***p0.001。4.敲减GNAQ后胃癌细胞MGC803克隆形成减少。定量观察发现,在MGC803细胞内,当细胞内GNAQ被sh GNAQ特异性敲减后,Con组和sh Con组平均集落数分别为210±9.2个、199±5.1个,Lv-sh GNAQ组为5.5±1.2个,***p0.001。5.敲减GNAQ后胃癌细胞MGC803细胞周期阻滞。定量显示:与sh Con组相比,sh GNAQ组G0/G1期细胞比例明显降低(19.30±0.53%vs.67.58±0.22%,***p0.001),S期细胞比例明显增高(68.15±0.42%vs.19.74±0.72%,***p0.001);sh Con、sh GNAQ组细胞在G2/M期细胞百分比无明显差异(17.33±0.23%,16.62±1.01%,p=0.825)。sub G1期细胞的比例检测结果显示:与sh Con组相比,sh GNAQ组sub G1期细胞比例明显增高(14.43±0.82%vs.1.23±0.09%,***p0.001)。6.敲减GNAQ的胃癌细胞MGC803中p53、p21上调,细胞周期相关蛋白Cyclin A下调,p-CDK2下调;ERK相关通路分子p-ERK及p-MEK下调。第二部分1.MPP8在胃癌术后患者的癌组织中表达明显高于癌旁正常组织(83%vs.52%,p0.001***)。MPP8的表达与胃癌患者不同临床特征进行比较,结果显示:MPP8在男性患者中的表达明显高于女性患者(86.1%vs.75.6%,p=0.035),在III/IV期患者的表达明显高于I/II患者期(88.6%vs.79.5%,p=0.046),在中分化患者明显高于低分化患者(90.2%vs.78.6%,p=0.011),在胃癌患者术后有辅助治疗组高于无辅助治疗组(86.3%vs.80.1%,p0.01)。然而对于不同年龄和不同肿瘤位置的胃癌患者来说,MPP8的表达无统计学差异。2.MPP8在癌组织中阳性表达的患者倾向于比MPP8阴性表达的患者更早出现疾病进展(复发或转移),这种情况在低分化的胃癌患者中更加显著。我们评估MPP8的表达与胃癌患者生存之间关系,结果显示:MPP8在癌组织中阳性表达与MPP8阴性表达的患者相比,3年DFS率分别是61.9%和74.5%(log-rank p=0.088),3年OS率分别是66.2%和78.4%(log-rank p=0.087)。亚组分析结果显示,这种情况在低分化的胃癌患者中更加显著,在低分化的胃癌患者中,MPP8阳性表达的患者与MPP8阴性表达的患者相比,3年DFS率分别为51.8%和72.2%(log-rank p=0.022),3年OS率分别为56.6%和74.5%,(log-rank p=0.017)。为了进一步评估MPP8在胃癌患者中表达情况与预后的关系,我们进行了DFS及OS的单因素及多因素COX回归分析。结果显示:分期、分化程度、辅助治疗可以作为胃癌的独立预后因素,而其他特征不能够作为胃癌的独立预后因素。3.敲减MPP8后胃癌细胞MGC803生长受限。我们监测了5天细胞的增殖活力情况。从第2天开始,可以观察到MGC803细胞在感染了Lv-sh MPP8(S1)和Lv-sh MPP8(S2)后细胞数逐渐低于Con和sh Con组,第5天时最为明显,Lv-sh MPP8(S1)和Lv-sh MPP8(S2)组的细胞数目分别为sh Con组的28%和20%左右,**p0.01和**p0.01。4.敲减MPP8后胃癌细胞MGC803克隆形成减少。在MGC803细胞内,当细胞内MPP8被sh MPP8(S1)特异性敲减后,Con组和sh Con组平均集落数相近,分别为101±7.8个、96±2个,Lv-sh MPP8(S1)组为23.7±5.7个。**p0.01。当细胞内MPP8被sh MPP8(S2)特异性敲减后,Con组和sh Con组平均集落数相近,分别为107.7±9.0个、100.7±16.8个。在Lv-sh MPP8(S2)组为7.0±2.6个。**p0.01。5.敲减MPP8后胃癌细胞MGC803细胞周期阻滞。定量显示:与sh Con组相比,sh MPP8(S1)及sh MPP8(S2)组G0/G1期细胞比例明显降低(45.10±0.79%和38.54±0.75%vs.51.27±0.79%;**p0.01和**p0.01);与sh Con组相比,sh MPP8(S1)及sh MPP8(S2)组S期细胞比例明显增高(42.22±0.44%和45.19±0.78%vs.30.80±0.82%;**p0.01和**p0.01);sh Con、sh MPP8(S1)、sh MPP8(S2)组细胞在G2/M期细胞百分比无明显差异(17.94±0.94%,16.27±1.47%,12.68±0.85%)。我们又进行了sub G1期细胞的比例检测。结果显示:与sh Con组相比,sh MPP8(S1)及sh MPP8(S2)组sub G1期细胞比例明显增高(24.33±1.17%和36.34±0.28%vs.1.55±0.12%;**p0.01和**p0.01)。6.敲减MPP8后胃癌细胞MGC803凋亡增加。Annexin V/7AAD双染sh Con、sh MPP8(S1)及sh MPP8(S2)组MGC803,定量分析:与sh Con相比,sh MPP8(S1)及sh MPP8(S2)组细胞凋亡比例明显增加:Annexin V+/7AAD-的细胞数量比例分别为25.55±0.56%和24.62±0.32%vs.5.96±0.07%,**p0.01和**p0.01。Annexin V+/7AAD+的细胞数量比例分别为40.04±0.61%和64.18±0.23%vs.8.56±0.22%,**p0.01和**p0.01。7.敲减MPP8后胃癌细胞MGC803迁移和侵袭能力下降。Transwell-migration检测con、sh Con、sh MPP8(S1)及sh MPP8(S2)组MGC803细胞迁移能力。迁移细胞计数显示:在MGC803细胞中,sh Con组迁移细胞数为109.5±1.5,而sh MPP8(S1)和sh MPP8(S2)组迁移细胞数分别为4.7±1.4和77.9±1.7,迁移细胞数减少近96%和29%,**p0.01和**p0.01。MTT法检测细胞活力结果显示:在MGC803细胞中,sh MPP8(S1)和sh MPP8(S2)组细胞数分别约为sh Con组细胞数的24%和63%。**p0.01和**p0.01。8.MPP8调节细胞凋亡和转移相关通路分子影响胃癌生长和转移。敲减MPP8的胃癌细胞系MGC803中,p53上调,BCL-2下调,BAX上调,PARP上调;敲减MPP8后,N-cadherin下调,维持上皮细胞支架的E-cadherin仍然正常表达,Vimentin下调。结论:第一部分1.GNAQ在胃癌组织高表达。2.GNAQ敲减后胃癌细胞生长及增殖受限、细胞周期阻滞、凋亡增加。3.GNAQ通过p53/p21及MEK/ERK途径影响胃癌的发生发展。第二部分1.MPP8在胃癌组织高表达,MPP8在癌组织阳性表达的胃癌患者倾向于预后差,这种情况在低分化胃癌患者中更为显著。2.MPP8敲减后胃癌细胞生长增殖受限,周期阻滞,凋亡增加、侵袭迁移能力下降。3.MPP8通过p53/Bcl-2及EMT调节胃癌的生长和转移。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.2

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