“黄连—干姜”药对预防炎症性肠病及其相关结肠癌作用机制研究

发布时间：2019-04-11 09:01

【摘要】：目的:炎症性肠病是一种肠道的慢性复发性炎症性疾病,主要包含克罗恩病(Crohn' s Disease,CD)和溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis,UC),主要症状为腹痛、腹泻、黏液便及脓血便,大约一半的严重病例需要手术治,并且常常伴随严重的并发症,持续的慢性炎症还可以增加结直肠癌的发病风险,严重影响患者生活质量,并且,有研究表明,结直肠癌的发病风险与肠道炎症的严重程度和持续时间成正相关。黄连在治疗胃肠道炎症方面有着突出的优势,无论是结肠炎还是结肠癌均有一定的疗效,但是黄连为苦寒之品,长期服用会带来一些不良反应。"黄连-干姜"药对在中医临床上体现了寒温并用的思想,是导师在临床常用的一种配伍,能够缓解长期应用苦寒药治疗慢性疾病带来的一系列不良反应。本研究采用DSS诱导的小鼠结肠炎模型、巨噬细胞RAW264.7细胞和结肠癌细胞系HT29、HCT116作为研究对象,探讨"黄连-干姜"药对预防结肠炎的作用及机制,以及其对结肠癌细胞的促凋亡作用及机制。方法:1."黄连-干姜"药对主要化学成分的研究按1:1比例称取干姜、黄连共400g,加8倍量水,冷浸1h,微沸回流1h,倾出药液,再加7倍量水,微沸回流30min,倾出药液,合并两次的药液,滤纸过滤,减压浓缩,冷冻干燥,称量冻干粉重量为31.8g,备用。称取1g上述全方药冻干粉,加ddH20 20.96 M1,离心(14000 rpmx30 min),取上清液,即得含有0.6g/ml原药的溶液。根据文献,组建黄连和干姜两味药的化学成分信息库。建立"黄连-干姜"液质联用(UPLC/Q-T0F-MSS)的分析方法,并运用该方法对"黄连-干姜"化学成分进行分析。根据色谱保留时间、精确分子量、分子碎片峰、对照品信息和自建的两味组方药材的化学成分信息库,对主要色谱峰的来源进行了归属和鉴定,并且定量测定水提物中 berberine 和 6-gingerol 的含量。2."黄连-干姜"药对预防DSS诱导的小鼠结肠炎作用及机制研究将45只雄性C57BL/6小鼠随机分为空白组、模型组、中药低剂量[1.2g/(kg · d))组、中药中剂量(2.4g/(kg · d))组、中药高剂量(4.8g/(kg · d)]组,中药组预防性灌胃给药7d后(空白组和模型组灌胃等量生理盐水),在继续给予相应干预的同时,模型组、中药组分别给予3%DSS(Dextran Sulfate Dodium)水溶液自由饮用,每2d更换一次,连续饮用7d,空白组小鼠给予自来水自由饮用。记录每日疾病活动指数(Disease Activity Index DAI)评分,取材后测量结肠长度,HE染色观察结肠病理变化并记录病理组织学评分,计算脏器指数,ELISA法检测小鼠血浆中IL-6和TNF-α水平,Western blot法检测结肠上皮细胞中NF-κ B、JAK2和STAT3蛋白磷酸化水平,激光共聚焦显微镜检测结肠组织中NF-κ B和p-STAT3表达水平。3."黄连-干姜"药对预防LPS诱导RAW264.7细胞炎症反应及其机制研究MTT法检测0、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8mg/ml "黄连-干姜"水提物对巨噬细胞RAW264.7细胞的杀伤作用。预防性给予"黄连-干姜"水提物(0、0.5、1、2mg/ml)1h后,给予LPS刺激8h,ELSIA法检测培养基IL-6和TNF-α的含量,Western blot法检测RAW264.7细胞中STAT3磷酸化水平,免疫荧光法检测RAW264.7细胞中p-STAT3和NF-κ B表达水平。4."黄连-干姜"对结直肠癌细胞系HT29和HCT116的作用及机制研究MTT法检测0、1、2、4、6、8、15mg/ml "黄连-干姜"水提物对HT-29和HCT116细胞的杀伤作用,给予"黄连-干姜"水提物0、1、1.5mg/ml分别干预HT-29和HCT116细胞48h后,流式细胞仪PI/Annexin V-FITC双染色法检测细胞凋亡率,Western blot法检测Cleaved Caspase3蛋白表达水平和STAT3蛋白磷酸化水平。结果:1."黄连-干姜"药对主要化学成分的研究建立了 "黄连-干姜"药对液质联用的分析方法,并成功运用该方法对"黄连-干姜"药对化学成分进行了分析。根据色谱保留时间、精确分子量、分子碎片峰、对照品信息和自建的两味组方药材的化学成分信息库,对主要色谱峰的来源进行了归属和鉴定,归属并鉴定了 28个主要色谱峰,同时定量检测了 berberine的浓度为54.43 mM,6-gingerol 药物浓度为 2.2mM。2."黄连-干姜"药对预防DSS诱导的小鼠结肠炎作用及机制研究模型组动物在饮用3%DSS后从第2天开始,DAI较空白组均升高;与模型组比较,中药低剂量组在造模后DAI均降低,但仅在饮用3%DSS第2、4、6天差异才有统计学意义;中药中剂量组DAI于饮用3%DSS后除了第4天,均低于模型组,并持续至实验结束;中药高剂量组DAI于饮用3%DSS第2天即低于模型组,并持续至实验结束。模型组小鼠结肠长度较空白组明显缩短(P0.01);与模型组相比,中药低、中剂量组结肠长度增长(P0.05),中药高剂量组结肠长度显著增长(P0.01)。模型组结肠组织病理评分较空白组显著升高(P0.01);与模型组相比,中药低剂量组结肠组织病理评分无明显变化,中药中剂量组结肠组织病理评分降低(P0.05),中药高剂量组结肠组织病理评分显著降低(P0.01)。模型组小鼠血浆中IL-6含量较空白组显著上升(P0.01);与模型组相比,中药各个剂量组小鼠血浆中IL-6含量较模型组均显著降低(P0.01)。与空白组相比,模型组血浆中TNF-α含量显著上升(P0.01),与模型组相比,中药各个剂量组小鼠血浆中TNF-α含量较模型组均显著降低(P0.01)。结肠组织中NF-κ B、JAK2和STAT3蛋白活化水平模型组均显著高于空白组(P0.01);中药低、高剂量组小鼠肠上皮细胞中NF-κB蛋白磷酸化水平均比模型组明显降低(P0.01);和模型组相比,中药低、高剂量组肠上皮细胞中JAK2蛋白磷酸化水平显著降低(P0.01),中药各个剂量组肠上皮细胞中STAT3蛋白磷酸化水平显著降低(P0.01)。3."黄连-干姜"药对预防LPS诱导RAW264.7细胞炎症反应及其机制研究MTT结果显示"黄连-干姜"水提物作用36h对RAW264.7细胞半数致死浓度为3.79mg/ml,ELSIA结果发现"黄连-干姜"水提物可以显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子IL-6和TNF-α分泌水平,Western blot和免疫荧光结果显示"黄连-干姜"可以显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞中NF-κ B和STAT3蛋白的激活。4."黄连-干姜"对结直肠癌细胞系HT29和HCT116的作用及机制研究MTT结果显示"黄连-干姜"水提物可以显著抑制HT29和HCT116细胞的活力,作用48h的IC50分别为5.648mg/ml和2.43mg/ml。流式细胞仪检测发现"黄连-干姜"水提物可以显著促进HT29和HCT116的凋亡比率,Western blot结果显示"黄连-干姜"可以显著促进HT29和HCT116细胞中Cleaved Caspase3的表达,抑制STAT3蛋白的磷酸化。结论:1."黄连-干姜"药对水提物可以显著抑制DSS诱导的小鼠结肠炎模型症状体征,改善局部病理损伤,抑制DSS诱导的小鼠结肠炎模型血浆炎症因子的含量,其作用机制可能是通过抑制DSS诱导的小鼠结肠炎模型结肠局部NF-κ B信号通路及JAK2/STAT 3信号通路的激活而起作用。2."黄连-干姜"可以显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子TNF-α和IL-6的分泌,可能是通过抑制LPS诱导的RAW264.7细胞中NF-κ B和JAK2/STAT3信号通路的激活而起到了作用。3."黄连-干姜"药对可以显著抑制结肠癌细胞系HT29和HCT116的增殖,促进结肠癌细胞系HT29和HCT116的凋亡,可能是通过抑制结肠癌细胞系HT29和HCT116细胞中JAK2/STAT3通路关键蛋白STAT3的磷酸化而起到了作用。
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【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5

【参考文献】