O-甘露聚糖和甘露戊糖的高效合成研究

发布时间：2017-03-18 08:08

  本文关键词：O-甘露聚糖和甘露戊糖的高效合成研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：细胞表面结构复杂的糖链在生物体内多种生理和病理过程中扮演着重要角色。然而,由于自然界中糖结构的复杂性很难通过天然提取分离的手段获得足够量、高纯度的生物活性寡糖及其缀合物,因而糖链样品的来源成为制约糖结构和功能研究的一大瓶颈。而采用化学法和酶法进行体外寡糖合成则为糖链的获得提供了崭新的途径,是近年来糖科学研究的难点、热点和前沿领域。本论文以解决两类生物活性寡糖的来源性问题为目标,主要完成了两部分工作：1.完成了6个Core M1 O-甘露聚糖(O-mannose glycans)分子的化学酶法合成；2.完成了1个非对称3,6-分支甘露戊糖(Man5)的化学合成。1 Core Ml O-甘露聚糖的化学酶法合成O-甘露聚糖因其丰富的结构多样性和重要的生物学功能已成为近年来糖生物学研究的新热点和前沿领域。肌营养不良相关蛋白聚糖(a-dystroglycan, a-DG)表面的O-甘露聚糖能够与肌细胞外基质分子相结合以维持抗肌萎缩蛋白-糖蛋白复合物(dystrophin-glycoprotein complex, DGC)的正常结构和功能。因糖链生物合成途径异常而造成的α-DG表面O-甘露聚糖低表达,会引起各种类型先天性肌营养不良(congenital muscular dystrophies, CMDs)。此外,O-甘露聚糖还与肿瘤细胞转移和某些病毒对宿主细胞的入侵有密切关系。然而目前,O-甘露聚糖的生物合成途径及其与细胞外基质分子间相互作用的构效关系尚不十分清楚。要解决这些问题,首先就要获得足够量高纯度的O-甘露聚糖分子探针,结合糖的微阵列技术以发现生物合成途径中的相关酶类并揭示其催化机制,并在分子水平上深入研究这些糖链与细胞外基质分子间相互作用的机制。然而,由于立体选择性构建O-甘露聚糖结构中的唾液酸和岩藻糖糖苷键的挑战性,加之O-甘露聚糖结构的高度多样性,O-甘露聚糖的合成研究还远远落后于其生物活性研究：(1)已发展的策略均以某一个糖链结构为目标分子,且仅实现了O-甘露聚糖中2个结构(一个Core M1四糖和一个Core M3三糖)的合成;(2)已发展的化学合成策略存在路线冗长、糖苷化反应选择性低、工作量大而总收率低等多种弊端,已报道的酶法合成也多受限于所采用的哺乳动物酶的催化效率低、可溶性表达量低、底物适应性差等缺陷；(3)对于Core M1系列中更为复杂的含有N-羟乙酰神经氨酸化的N-乙酰乳糖胺(sLNGc)、路易斯X (Lewis x,Lex)和唾液酸化路易斯X(sialyl Lewis x, sLex)单元的四糖和五糖分子则尚未实现任何形式的合成。因此,急需发展一种能够覆盖尽可能多的该系列寡糖结构的多样化导向的高效合成策略。针对上述问题,本论文发展了一个多样化导向的基于连续“一锅多酶”(one-pot multi-enzyme, OPME)糖苷化的Core M1 O-甘露聚糖化学酶法合成策略,主要开展了以下几方面工作：(1) Core M1 O-甘露二糖氨基酸的化学法合成采用基于丁二酮、叔丁基二甲基硅基的保护基策略和两步高效的化学糖苷化反应,灵活高效地合成了末端连有丝氨酸的Core M1 O-甘露聚糖核心二糖。(2) Core M1 O-甘露聚糖糖链的酶法延伸以化学合成的Core M1 O-甘露二糖丝氨酸为起始底物,将三个细菌来源的分别用于β1-4半乳糖苷键、α2-3唾液酸糖苷键、α1-3岩藻糖苷键构建的“一锅多酶”糖苷化体系用于Core M1 O-甘露聚糖糖链的仿生化延伸,并合理调整酶催化反应顺序,实现了Core M1 O-甘露聚糖分子的多样化合成。最终以每步酶反应70%以上的收率首次实现了6个末端连有丝氨酸的CoreM1 O-甘露聚糖的高效、大量合成,其中包括含有sLNGc、Lex、sLex单元的复杂Core M1 O-甘露四糖和五糖的首次全合成。2非对称3,6-分支甘露戊糖(Man5)的化学合成Man5是寡聚甘露糖和复杂型N-聚糖所共有的核心结构,也是HIV-1包膜糖蛋白gp120表面糖链中含量最为丰富的结构。大量证据表明,Man5结构域是HIV人单克隆抗体2G12的识别位点,也是可与HIV包膜结合的凝集素cyanovirin-N (CVN)的最初结合靶点。因而以Man5为基础构建成簇抗原表位是抗HIV糖疫苗研究的热点,且gp120寡聚甘露糖与受体相互作用的研究也需要大量高纯度Man5样品。然而,目前寡聚甘露糖的制备多采用化学合成,且多集中在线性结构和对称的分支结构上,对此非对称分支Man5尚未发展出非常高效的合成方法。针对上述问题,本论文发展了一个由三个砌块组成的基于连续区域选择性糖苷化的一锅法合成策略,开展了以下工作：(1)合理设计并高效合成了三个甘露糖砌块；(2)从三个砌块出发,采用分步法优化了两步区域选择性糖苷化合成全保护Man5的条件；(3)基于分步法确定的糖苷化反应条件,以相同的三个砌块采用一锅法以61%的总收率合成了Man5,且该收率远高于上述分步法38%的总收率。3总结和创新点本论文解决了两类生物活性寡糖特别是Core M1 O-甘露聚糖的大量获得性问题,为具有类似结构的寡糖分子的合成提供了新的思路,也为后续相关生物学研究及未来相应疾病的诊断治疗奠定了基础。主要创新点如下：(1)首次发展了一个基于丁二酮、叔丁基二甲基硅基和两步高效的化学糖苷化反应的Core M1 0-甘露二糖丝氨酸砌块化学合成策略；(2)首次发展了一个基于细菌来源“一锅多酶”糖苷化体系的多样化导向的Core M1 0-甘露聚糖化学酶法合成策略；(3)首次实现了6个Core M1 O-甘露聚糖的大量、高效化学酶法合成；(4)首次实现了含有sLNGc、Lex、sLex单元的Core M1 O-甘露四糖和五糖结构的全合成；(5)首次发展了一个一锅法化学合成策略,完成了1个非对称3,6-分支甘露戊糖(Man5)的高效化学法合成；(6)本论文中涉及的44个糖砌块中24个为首次合成的新化合物,其中3个具有全新的糖链骨架结构。
【关键词】：化学酶法合成 肌营养不良相关蛋白聚糖 O-甘露聚糖 一锅多酶 唾液酸化 岩藻糖化 甘露戊糖
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R914
【目录】：

• 摘要8-11
• Abstract11-16
• 缩略语说明16-18
• 第一章 前言18-46
• 1 引言18-23
• 1.1 细胞表面的糖链18-21
• 1.2 化学糖生物学21-23
• 2 寡糖合成研究进展23-42
• 2.1 寡糖的化学法合成23-37
• 2.2 寡糖的酶法合成37-39
• 2.3 寡糖的化学酶法合成39-41
• 2.4 寡糖合成中存在的问题41-42
• 3 糖链在化学糖生物学中的应用42-44
• 4 本论文的研究内容和拟解决的问题44-46
• 第二章 Core M1 O-甘露聚糖的化学酶法合成46-84
• 1 O-甘露聚糖的研究进展46-52
• 1.1 肌营养不良相关蛋白聚糖46-48
• 1.2 O-甘露聚糖的结构和生物合成途径48-50
• 1.3 O-甘露聚糖的研究趋势50-52
• 2 O-甘露聚糖的合成进展及存在的问题52-53
• 2.1 O-甘露聚糖的合成进展52-53
• 2.2 O-甘露聚糖合成中存在的问题53
• 3 课题设计53-61
• 3.1 课题的提出53-58
• 3.2 逆合成分析58-61
• 4 Core M1 O-甘露聚糖的化学酶法合成61-80
• 4.1 Core M1 O-甘露二糖丝氨酸1的化学法合成61-68
• 4.2 Core M1 O-甘露三糖丝氨酸2的酶法合成68-70
• 4.3 Core M1 O-甘露四糖丝氨酸3,4的酶法合成70-75
• 4.4 Core M1 O-甘露寡糖丝氨酸5,6的酶法合成75-80
• 5 本章小结80-84
• 第三章 甘露戊糖的化学合成84-118
• 1 甘露戊糖研究进展84-86
• 1.1 N-聚糖(N-glycans)的结构分类84-85
• 1.2 甘露戊糖(Man5)的结构和功能85-86
• 2 甘露戊糖的合成进展及存在的问题86-89
• 3 课题设计89-92
• 4 甘露戊糖的化学合成92-116
• 4.1 单糖给体砌块24的合成92-94
• 4.2 单糖受体砌块25的合成94-99
• 4.3 三糖给体砌块26的合成99-107
• 4.4 甘露戊糖44的分步法合成107-113
• 4.5 甘露戊糖44的“一锅法”合成113-115
• 4.6五糖砌块44的脱保护115-116
• 5 本章小结116-118
• 第四章 全文总结与展望118-123
• 1 全文总结118-121
• 2 创新点121-122
• 3 本论文的不足之处122
• 4 展望122-123
• 第五章 实验部分123-148
• 1 一般方法123
• 2 酶的表达和纯化123-126
• 3 化学与酶法合成126-148
• 参考文献148-155
• 附录一：重要化合物NMR图谱155-207
• 附录二：攻读学位期间发表的学术论文207-208
• Article 1208-214
• Article 2214-220
• 致谢220-221
• 学位论文评阅及答辩情况表221

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本文编号：254171