三七皂苷R1对新生鼠缺血缺氧性脑病的保护作用及其机制的初步研究

发布时间：2019-09-29 16:31

【摘要】：新生儿缺氧缺血性脑病(Hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)是引起新生儿死亡、急性或慢性神经系统损伤及脑发育滞后的主要原因之一。脑缺血缺氧最常见也是最重要的病理损伤特点为神经元的凋亡甚至死亡,因此在缺血缺氧发生后,保护神经元的正常存活、减少细胞凋亡是研究和解决神经系统缺血缺氧性疾病的最重要策略之一。三七皂苷R1,作为中药三七的提取物,具有类雌激素的作用,它可以通过雌激素受体发挥抗炎、抗氧化、抗凋亡和抗神经损伤等多种保护作用。但NGR1对新生儿缺血缺氧性脑病是否具有保护性作用仍未见报道。目前认为,内质网应激(ER stress)在缺血缺氧导致的细胞损伤过程中发挥重要的作用,且重要的是ER stress受内质网内钙离子平衡调节。当机体遭受不良刺激时,内质网内钙离子大量释放,引起钙离子失衡。在内质网内,钙离子的流出主要通过IP3受体(IP3R)通道,而这一通道的激活关键在于IP3R与1P3结合。当病理情况下,PLC的磷酸化增多可以导致IP3的表达增高,。因此,深入探讨NGR1是否能够通过节PLC/IP3R以及后续对Ca2+及内质网应激通路的影响尤为重要。综上,本研究以NGR1、雌激素受体、ER stress和NGR1、PLC、IP3R,Ca2+为轴心线索,初步探讨NGR1在HIE中的作用及机制。目的采用原代培养神经元OGD/R模型及出生7天SD大鼠缺氧缺血性脑损伤模型,探讨NGR1在缺血缺氧性损伤中对神经细胞的保护作用及其机制。方法:1.对原代培养的SD大鼠胎鼠皮层神经元细胞,采用氧糖剥夺(Oxygen-Glucose Deprivation,OGD)1.5 h复糖氧4 h或24 h的方法建立大鼠皮层神经元OGD/R模型;同时取用出生7天SD乳鼠,使用颈动脉结扎和缺氧环境处理的方法建立体内HIE模型。2.分组1:对照组(Control)假模型组(sham组),模型组(OGD/R;HIE),模型+NGR1治疗组(OGD/R+NGR1;HIE+NGR1),溶剂对照组(vehicle组)分组2:对照组(Control),模型组(OGD/R;HIE),模型+NGR1治疗组(OGD/R+NGR1;HIE+NGR1),OGD/R+NGR1+ICI-182780组(ICI-182780:雌激素受体阻断剂);溶剂对照组(vehicle组)分组3:对照组(Control),模型组(OGD/R;HIE),模型+NGR1治疗组(OGD/R+NGR1;HIE+NGR1),OGD/R+NGR1+m-3MFBS组(m-3MFBS:PLC激动剂)组3.检测指标:(1)通过MTT法检测神经元细胞存活率;LDH检测细胞膜完整性;Hochest33342染色检测细胞凋亡。(2)通过TTC染色检测大鼠脑脑梗死面积;HE染色观察脑组织病理损伤;TUNEL染色检测细胞凋亡。(3)使用Western Blot方法检测不同蛋白的表达。(4)使用钙离子荧光探针检测缺血缺氧后内质网内钙离子浓度变化。结果:1.相比于OGD/R组,OGD/R+NGR1组神经元存活率明显提高,LDH漏出率降低,细胞凋亡减少且呈浓度依赖性。较HIE组,HIE+NGR1组脑梗死面积明显缩小;病理损伤减轻;TUNEL阳性细胞数目减少等。2.ICI-182780可阻断NGR1对皮层神经元和新生大鼠脑的缺血缺氧性损伤保护作用。与OGD/R+NGR1组比较,OGD/R+NGR1+ICI-182780组神经元存活率下降,凋亡增多,LDH漏出率增高;同时在体内模型中,与HIE+NGR1组相比,HIE+NGR1+ICI-182780组脑梗死面积明显增加、病理损伤加重,TUNEL阳性细胞数目增加等。3.在OGD/R或HIE后,ER stress过程中凋亡相关蛋白被激活,NGR1能够降低凋亡相关蛋白的表达,但NGR1的这一作用被ICI-182780抑制。4.在缺血缺氧损伤中,NGR1能够抑制PLC的活化和IP3R1的表达增高;且NGR1能够抑制IP3R1介导的内质网钙离子释放结论无论是体内或体外条件下,NGR1均能够明显减少缺血缺氧导致的神经元的损伤。且NGR1的保护作用可能通过两条途径发挥,一方面NGR1可能通过雌激素受体调节ER stress来发挥对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的保护作用;另一方面在缺血缺氧性脑损伤中,NGR1能够调节PLC/IP3R,进而调节内质网钙离子释放,从而调节细胞损伤。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5

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