【摘要】：Tim-3于2001年被发现,属于Tim(T-Cell-Ig-mucin)家族的一员。Tim-3起初被发现表达于活化的T细胞表面。Tim-3与其配体Gal-9结合后,能抑制T细胞功能。Tim-3在T细胞的高表达导致肿瘤及感染性疾病的免疫耐受,被认为是继CTLA-4,PD-1之后的新一代免疫干预靶点。我们前期研究发现,Tim-3不只作用于T细胞,也抑制巨噬细胞等天然免疫细胞的功能。Tim-3能通过结合STAT1,抑制STAT1-miRNA155通路,从而抑制巨噬细胞向M1方向极化。Tim-3还能抑制LPS诱导的NF-kB活化,负性调控巨噬细胞的功能。单核细胞增生李斯特菌是一种人畜共患病的病原菌。李斯特菌因为具有危害相对较低,易于体外培养等特点而成为研究胞内菌感染的模型。它主要以食物为传染媒介,能引起人、畜李斯特菌病,感染后主要症状为败血症和脑膜炎。单核细胞增生李斯特菌是一种胞内寄生菌。胞内寄生菌是指能侵入细胞繁殖、随细胞播散,并逃避抗体攻击的一类致病菌。其中包括鼠疫杆菌、布鲁氏菌和结核杆菌等烈性传染病。单核细胞增生李斯特菌进入体内首先在模式识别受体的协助下被巨噬细胞吞噬。然后巨噬细胞启动呼吸氧爆发等多种应激机制,介导对李斯特菌的杀伤。最后抗原表位经加工、处理,由MHC-I类分子呈递至CD8+T细胞后,CD8+T细胞分化成CTL细胞杀伤感染李斯特菌的细胞,来消灭李斯特菌感染。Tim-3在巨噬细胞中发挥抑制作用,巨噬细胞在抗李斯特菌感染中发挥重要作用。在巨噬细胞中通过基因芯片发现,Tim-3能抑制抗感染免疫相关分子CD36和MHC-I类分子的表达。那么提出假设,Tim-3可能通过影响巨噬细胞,进而抑制机体抗感染功能。如果能,那Tim-3又是通过什么机制来影响巨噬细胞的抗感染功能的?为了探索这个问题,在转基因高表达Tim-3和阻断Tim-3信号的小鼠中发现,Tim-3能抑制小鼠防御单核细胞增生李斯特菌的感染。转基因高表达Tim-3小鼠腹腔和脾脏细菌载量增加,肝脏损伤加重。小鼠体内阻断Tim-3信号则损伤减轻。在进一步的研究中发现,Tim-3抑制抗感染免疫是通过抑制巨噬细胞对单核细胞增生李斯特菌吞噬、杀伤和抗原递呈功能实现的。Tim-3通过抑制Nrf2-CD36抑制巨噬细胞对单核细胞增生李斯特菌的吞噬。用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测发现,Tim-3高表达的转基因小鼠的腹腔巨噬细胞对单核细胞增生李斯特菌的吞噬量显著低于正常野生型小鼠的腹腔巨噬细胞的吞噬量。与此同时,加入stim-3蛋白阻断tim-3信号的raw264.7细胞对单核细胞增生李斯特菌的吞噬量显著高于加入对照蛋白的raw264.7细胞的吞噬量。通过基因芯片、rt-pcr与流式细胞检测发现,tim-3高表达会抑制巨噬细胞表达cd36,而阻断tim-3信号会促进巨噬细胞表达cd36。加入sso和stim-3阻断蛋白用流式细胞仪检测对单核细胞增生李斯特菌的吞噬发现,cd36能介导巨噬细胞对单核细胞增生李斯特菌的吞噬,而tim-3主要是通过抑制cd36的表达从而抑制巨噬细胞对单核细胞增生李斯特菌的吞噬。通过免疫沉淀、westernblotting和高内涵分析,tim-3信号高表达不但能通过增加nrf2泛素化来降低nrf2蛋白的表达水平,还能抑制nrf2转位至细胞核发挥转录功能。同时,阻断tim-3信号则可以通过降低泛素化来增加nrf2蛋白的表达水平,还能促进nrf2转位至细胞核发挥转录功能。通过流式细胞检测,nrf2sirna敲低的raw264.7细胞能显著抑制stim-3蛋白阻断tim-3信号后引起的raw264.7细胞对单核细胞增生李斯特菌的吞噬增多。而且通过流式细胞检测,敲低raw264.7细胞的nrf2表达或加入脱泛素酶抑制剂pr619抑制nrf2脱泛素后,能显著抑制stim-3蛋白阻断tim-3信号后引起的raw264.7细胞cd36的表达上调。这些结果从多个方向说明,tim-3抑制巨噬细胞的cd36的表达,从而抑制巨噬细胞对病原微生物的吞噬功能,主要是通过抑制nrf2泛素化来降低nrf2蛋白的表达水平和抑制nrf2核转位发挥转录功能。tim-3通过抑制nrf2-ho-1抑制巨噬细胞对单核细胞增生李斯特菌的杀伤。用cfu计数和激光共聚焦显微镜检测发现,tim-3高表达的转基因小鼠的腹腔巨噬细胞对单核细胞增生李斯特菌的杀伤量显著低于正常野生型小鼠的腹腔巨噬细胞的杀伤量。与此同时,加入stim-3蛋白阻断tim-3信号的raw264.7细胞对单核细胞增生李斯特菌的杀伤量显著高于加入对照蛋白的raw264.7细胞的杀伤量。通过rt-pcr分析,tim-3高表达会抑制腹腔中巨噬细胞表达ho-1,阻断tim-3信号会促进巨噬细胞表达ho-1。敲低raw264.7细胞的nrf2表达或加入脱泛素酶抑制剂pr619抑制nrf2脱泛素后,能显著抑制stim-3蛋白阻断tim-3信号后引起的raw264.7细胞ho-1的表达上调。阻断tim-3信号会促进raw264.7细胞表达il-1β,tim-3通过ho-1影响il-1β的表达,从而影响机体对单核细胞增生李斯特菌的杀伤。Tim-3抑制巨噬细胞的HO-1的表达,从而抑制IL-1β分泌与巨噬细胞对病原微生物的杀伤功能,主要是通过抑制Nrf2泛素化来降低Nrf2蛋白的表达水平和抑制Nrf2核转位发挥转录功能。Tim-3通过抑制NLRC5-MHC-I抑制巨噬细胞对单核细胞增生李斯特菌的抗原递呈功能。通过RT-PCR和流式细胞分析,Tim-3高表达会抑制腹腔中巨噬细胞MHC-I类分子的表达,阻断Tim-3信号会促进巨噬细胞MHC-I类分子的表达。Tim-3高表达会抑制小鼠腹腔中的巨噬细胞MHC-I类分子对OVA257-264的体外抗原递呈。阻断Tim-3信号会促进小鼠腹腔巨噬细胞对MHC-I类分子对OVA257-264的体外抗原递呈。Tim-3高表达会抑制小鼠腹腔中的巨噬细胞在单核细胞增生李斯特菌感染过程中MHC-I类分子对OVA257-264的抗原递呈进而抑制MHC-I类分子对CD8+T细胞的激活。通过Western Blotting,RT-PCR和双荧光素酶报告分析,阻断Tim-3通过STAT1促进巨噬细胞NLRC5的表达。Tim-3高表达能通过抑制巨噬细胞STAT1对NLRC5的转录,进而降低NLRC5的蛋白表达水平。通过流式细胞、RT-PCR和双荧光素酶报告分析,敲低RAW264.7细胞的NLRC5表达后,能显著抑制sTim-3蛋白阻断Tim-3信号后引起的RAW264.7细胞MHC-I的表达上调。转入Tim-3质粒的HEK-293-T细胞的NLRC5-MHC-I报告的荧光素表达水平明显少于未转入Tim-3质粒的HEK-293-T细胞。这些结果从多个方面说明,Tim-3高表达会通过STAT1、NLRC5抑制腹腔中巨噬细胞MHC-I类分子的转录和表达。本研究发现了Tim-3能抑制小鼠对单核细胞增生李斯特菌感染的抵抗,其中主要包括通过Tim-3-Nrf2-CD36通路抑制巨噬细胞对单核细胞增生李斯特菌的吞噬,通过Tim-3-Nrf2-HO-1通路抑制巨噬细胞对单核细胞增生李斯特菌的杀伤,通过Tim-3-STAT1-NLRC5-MHC-I通路抑制巨噬细胞对单核细胞增生李斯特菌的抗原递呈功能和对杀伤性CD8+T细胞的激活。因此,Tim-3抑制抗感染免疫是通过抑制巨噬细胞对单核细胞增生李斯特菌的吞噬、杀伤和抗原递呈功能来实现的。本项研究充分证明Tim-3作为共抑制分子的一员,在抗感染免疫的过程中发挥重要作用,为共抑制分子的研究提供了新的视野。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R392
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本文编号：
2550072
