miR-335-5p在肾癌中的抑癌作用及其分子机制研究

发布时间：2017-03-20 15:11

  本文关键词：miR-335-5p在肾癌中的抑癌作用及其分子机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景：肾癌又称肾细胞癌(renal cell carcinoma RCC)是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一。其发病率在泌尿系统中仅次于膀胱癌,。肾癌对放疗及化疗均不敏感,手术切除仍是目前最佳的治疗手段,但术后复发率约为20%-40%。由于肾癌的化疗及放疗抵抗性,临床上没有有效的术后治疗手段。目前的研究仍然对肾癌的发生以及进展的机制缺乏足够深入的理解。探索肾癌的发生发展分子机制,寻找有效的诊断、预后分子标志物及分子治疗靶点,具有重要的意义。miRNA是一类长度约为20-24个核苷酸的由内源基因编码的非编码RNA单链分子。越来越多的研究证明这些普遍存在的非编码小分子在真核基因表达调控中有着广泛的作用。miRNA的表达水平具有分化的时序性和位相性。对于各类疾病,尤其是肿瘤而言,miRNA也出现了时间和空间上的表达异常,本研究希望在肾癌中寻找可能的异常表达,并发现其在基因调控中所扮演的作用。目的：在收集的肾癌患者手术切除的标本组织中采用荧光定量PCR的方法检测miR-335-5p的表达情况,分析影响miRNA表达水平的表观遗传机制。以获得性功能实验观察miR-335-5p在肾癌细胞系786-O, ACHN和Caki-1中的生物学功能。并且根据生物信息学知识,对潜在的miR-335-5p作用靶点进行验证,并通过靶点分子的沉默和过表达实验,证实miR-335-5p对靶点的调控意义,探索可能存在的分子调控机制。方法：1.在25对配对的肾癌组织标本检测miR-335-5p的相对表达量,统计分析miR-335-5p在肾癌及癌旁肾脏组织中的表达差异,并分析不同病例级别与分期的肾癌中miR-335-5p的表达情况；2.通过体外转染miR-335-5p模拟体(mimic)的方式来进行获得性功能实验。通过CCK-8、平板克隆形成、Transwell小室法和流式细胞周期检测等手段来分析上调miR-335-5p的表达对细胞增殖及迁移侵袭能力带来的影响；3.结合在线生物信息学工具对miR-335-5p进行靶基因预测,然后利用Real Time PCR, Western Blot等验证靶基因mRNA以及蛋白表达量的变化,并利用荧光素酶双报告系统对miR-335-5p的靶序列进行鉴定,并使用RNA干扰、质粒过表达拯救实验等进一步证实靶向调控关系。结果：1.在收集的25例肾癌组织标本中,有19例为miR-335-5p相对低表达,占76%。癌组织中]miR-335-5p表达量平均约为癌旁组织的1/10。2.肾癌细胞系786-0,ACHN和Caki-1及22例肾癌组织中miR-335-5p启动子区CpG岛较癌旁正常组织呈现高度甲基化状态,提示DNA甲基化可能与miR-335-5p在肾癌中的低表达有关。3.体外转染miR-335-5p mimic至肾癌786-0, ACHN和Caki-1细胞株从而过表达miR-335-5p,可以抑制其生长。并且其抑制率呈现时间与浓度依赖性,在50nMmiR-335-5p mimic处理72小时后,其抑制率可达到30-40%(p0.05)。流式细胞周期检测发现50nM miR-335-5p mimic作用48小时后可以诱导三种肾癌细胞发生G1期阻滞,而流式细胞凋亡检测提示miR-335-5p过表达并不能诱导细胞凋亡。miR-335-5p过表达可以抑制肾癌细胞体外克隆形成能力。Transwell小室实验提示miR-335-5p过表达不能抑制肾癌细胞的侵袭和迁移能力。4.成功构建裸鼠的皮下荷Caki肿瘤模型。瘤内给予脂质体包裹的miR-335-5p,观察到移植瘤的生长受到明显抑制,同时检测到瘤组织中增殖相关蛋白Ki67和p-Rb表达下调。5.通过在线软件的分析,将序列比对程序分析结果与细胞表型变化相结合,预测CDK2、CCNE2可能是miR-335-5p的靶基因,同时通过Real-time RT-PCR和Western Blot实验检测到CDK2和CCNE2在过表达miR-335-5p后mRNA水平和蛋白水平都有下调。进一步荧光素酶报告系统分析证实CDK2和CCNE2是miR-335-5p的直接作用靶点,其3'-UTR中存在miR-335-5p调控的作用序列。6.miR-335-5p对肾癌细胞的抑制增殖作用部分通过AKT/FOXO1信号通路实现。结论：1.与癌旁对照组织相比,肾癌组织中miR-335-5p相对表达量显著下调。但是本研究未能提示miR-335-5p表达量高低与肾癌的恶性程度相关。2.体外转染miR-335-5p mimic使其过表达使得肾癌细胞株发生细胞周期阻滞及增殖抑制。同时,miR-335-5p的过表达还削弱了肾癌细胞的克隆形成能力。3.CDK2和CCNE2是miR-335-5p的直接作用靶点,还可以通过/AKT/FOXO1信号通路发挥抑制增殖作用。
【关键词】：肾癌 微小RNA 增殖 G1期阻滞 CDK2 CCNE2
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.11
【目录】：

• 致谢6-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-12
• 英文缩写一览表12-15
• 引言15-20
• 参考文献17-20
• 1. miR-335-5P在人肾癌中的表达情况及调控机制20-47
• 1.1 前言20-22
• 1.2 材料与方法22-33
• 1.3 结果33-40
• 1.4 讨论40-42
• 1.5 结论42-43
• 1.6 参考文献43-47
• 2. miR-335-5P对肾癌细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响47-70
• 2.1 前言47-49
• 2.2 材料和方法49-56
• 2.3 结果56-64
• 2.4 讨论64-66
• 2.5 结论66-67
• 2.6 参考文献67-70
• 3. miR-335-5P的靶基因及影响肾癌的分子机制探讨70-100
• 3.1 前言70-72
• 3.2 材料与方法72-86
• 3.3 结果86-93
• 3.4 讨论93-96
• 3.5 结论96-97
• 3.6 参考文献97-100
• 小结与展望100-101
• 综述101-111
• 参考文献107-111
• 作者简历及在读期间所取得的科研成果111-112
• 已发表文章112-122

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 Wenwen Jia;Wen Chen;Jiuhong Kang;;The Functions of MicroRNAs and Long Non-coding RNAs in Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells[J];Genomics,Proteomics & Bioinformatics;2013年05期

2 何龙;高江平;;MicroRNAs在肾细胞癌中调控作用机制及应用[J];创伤与急危重病医学;2014年03期

3 李璐;李婷;李沐;吴炎;齐琳;崔东明;胡薇;;MiRNA-93-5p对VEGF的转录调控及其与梅花鹿茸细胞增殖的关系[J];东北林业大学学报;2014年11期

4 赵建;刘建亮;;miR-183及MAPK1蛋白在非小细胞肺癌中的表达及其意义[J];解剖学研究;2014年05期

5 陈胜;王伟;王亮;张颖;贾战生;;胞外体在微RNA转运过程中的作用[J];国际检验医学杂志;2014年24期

6 陈胜;王亮;曹爽;闻勤生;;外周血中microRNA用于肝癌诊断的研究进展[J];国际消化病杂志;2014年06期

7 王非一凡;李学军;;miR221/222家族在胶质瘤中的研究进展[J];国际神经病学神经外科学杂志;2014年06期

8 蒋艳辉;宋鑫;;基于MicroRNAs及其靶基因的化学预防药物对肿瘤抑制的作用[J];中国肺癌杂志;2015年04期

9 苏正元;舒利民;Jong Hun Lee;Franciso Fuentes;王虎;吴天元;余四旺;Ah-Ng Tony Kong;;食用植物成分和中药用于癌症化学预防:Nrf2,表观基因组学,癌症干细胞(英文)[J];化学进展;2013年09期

10 高原;邹阳;于影;林金德;张春丽;温传俊;沈干;;基于双荧光素酶报告基因系统建立miR-140生物传感器[J];东南大学学报(医学版);2014年02期

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 杨浩;miR-140-5p通过靶向调节TGFBR1和FGF9抑制肝细胞癌增殖和侵袭转移[D];中南大学;2013年

2 刘可;miR-34a通过抑制HMGB1调节视网膜母细胞瘤自噬及化疗效果的机制研究[D];中南大学;2013年

3 潘伟波;骨肉瘤细胞MG63中内源性microRNA-27a对骨肉瘤恶性行为的影响及其调控靶基因的研究[D];浙江大学;2013年

4 赵丽霞;miR-137对卒中后抑郁大鼠模型的治疗作用及其作用机制研究[D];山东大学;2013年

5 金捷;miRNA-218下调TIAM1，MMP2和MMP9抑制骨肉瘤细胞迁移侵袭的实验研究[D];武汉大学;2013年

6 王婷;黄芩苷通过miR-126途径抑制乳腺癌机制的研究[D];湖南中医药大学;2014年

7 廉吉虎;MicroRNA-122在肾透明细胞癌组织中的表达及在肾透明细胞癌侵袭转移中分子调控机制的研究[D];吉林大学;2014年

8 刘建明;microRNA在胃癌细胞株MKN-45肿瘤干细胞中的表达谱研究[D];苏州大学;2014年

9 庞迎新;miRNA-519d、双联苄化合物DHA2对卵巢癌的生长抑制作用及其机制研究[D];山东大学;2014年

10 孙权权;miR-200c靶向UBQLN1调节自噬及乳腺癌的辐射抵抗[D];南方医科大学;2014年

  本文关键词：miR-335-5p在肾癌中的抑癌作用及其分子机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：257995