Wee1激酶抑制剂MK-1775抗急性淋巴细胞白血病的效应及机制研究

发布时间：2017-03-20 18:00

  本文关键词：Wee1激酶抑制剂MK-1775抗急性淋巴细胞白血病的效应及机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景：急性淋巴细胞白血病(ALL)是一种发生于淋巴造血组织的常见恶性肿瘤,严重威胁人类健康。成人ALL预后一般较差,目前常采用的联合化疗虽然能使病情获得缓解,但多数患者最终因耐药或者疾病复发而治疗失败。此外化疗往往伴有明显的副作用如发生感染、出血以及脏器功能受损等。异基因造血干细胞移植虽然能使部分患者治愈,但移植风险高,部分患者无法找到合适供者,移植并发症移植物抗宿主病(GVHD)往往严重影响患者生活质量。因此寻找高效低毒的药物对于ALL治疗至关重要。细胞周期检点在调节细胞有丝分裂、促进损伤DNA的修复和维护细胞基因结构稳定中起着重要作用。细胞周期调控异常与肿瘤发生密切相关[1]。Weel属于丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶家族,是一种G2/M期检验点激酶,调节细胞G2/M期转换、组蛋白合成以及DNA损伤的修复[2]。Weel在多种实体肿瘤中高表达,且高表达者预后差[3]。通过RNAi抑制Weel的表达或者药物抑制其活性,肿瘤细胞从S期或G2期提前进入M期,未完成DNA的合成和修复,表现为细胞组蛋白合成异常,二极纺锤体形成障碍,染色体分散存在,最终退出有丝分裂,引发细胞凋亡,称作“有丝分裂障碍”或者“有丝分裂灾难”(mitotic catastrophe)"[4]。MK-1775是一种选择性Weel激酶抑制剂,在乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、髓系白血病等多种肿瘤中表现出抗肿瘤活性[3,5-8]。因此Weel有望成为肿瘤治疗的新靶点。然而目前Weel和ALL的关系还未见报道。AKT/mTOR和Notch通路与ALL的关系。在ALL中mTOR通路通常被活化[9]。mTOR的Ser2448位点被AKT磷酸化而活化,活化的mTOR通过磷酸化下游40S核糖体S6蛋白激酶参与调节目的基因的翻译,促进细胞存活、增生、血管生成和化疗耐药。AKT抑制剂MK2206或者mTOR抑制剂雷帕霉素能通过抑制该通路表现出一定的抗白血病效应[10]。Notch是另一条在进化过程中高度保守的信号通路。在哺乳动物中,Notch通路由配体(Jaggedl, Jagged2,DLL1,DLL3和DLL4)、受体(Notch1-4)和靶分子(Hes1、Hes5)组成。Notch分子由胞外区、跨膜区和胞内区组成。在活化过程中经过3次裂解,其胞内段Notch-IC结合RBPJK(也称作CSL和CBF-1),活化靶基因Hes转录因子,调节下游基因表达从而调节细胞的增生和分化。根据细胞类型和肿瘤环境的不同,Notch在不同组织中表现出不同的生物活性。研究发现Notch1的活化突变可以出现在所有亚型的T-ALL中,包括有TAL1,HOX11, HOX11L2, LYL1, MLL-ENL和AF10-CALM基因的T-ALL中。活化的Notch受体通过靶蛋白Hes调节目的基因的转录和翻译[11]。在T-ALL中,Notch活化促进T-ALL细胞的增生、浸润和化疗耐药,促进白血病的发生和进展,是一种促癌基因[12]。在B-ALL中,该通路的作用研究较少,与B-ALL发生的关系尚需进一步研究。此外,mTOR和Notch信号通路均不是孤立存在的,两者可发生相互联系。如mTOR可通过上调Notch1通路影响细胞分化是肿瘤发生的机制之一[13]。Weel是否与急性淋巴细胞白血病发病相关,Weel抑制剂能否发挥抗ALL的效应,机制如何还未见报道。Weel、mTOR、Notch都与细胞增生、存活和肿瘤预后相关,Weel抑制剂是否通过改变PI3K/AKT/mTOR和Notch通路发挥抗白血病效应还需进一步研究。研究目的：检测Weel在ALL中的表达水平,研究Weel激酶抑制剂MK-1775对ALL细胞活性、周期调控、凋亡的影响以及与mTOR和Notch信号通路的关系,初步阐述Weel抑制剂MK-1775抗ALL的机制,为临床应用提供理论依据和实验基础。研究方法：1.收集初诊的成人ALL患者和健康对照者的骨髓标本,淋巴细胞分离液分离骨髓中的单个核细胞,荧光定量RT-PCR检测Weel mRNA在患者和对照组的表达水平。2.MTT法检测Weel抑制剂MK-1 775和化疗药物阿霉素对细胞活性的影响：将ALL细胞Nalm-6、Jurkat、Sup-T1、Molt-4和正常骨髓基质细胞HS-5接种于96孔培养板中,加入不同浓度的MK-1775、阿霉素或者两者联合培养24、48、72小时,MTT法检测MK-1775对ALL细胞和HS-5活性的影响,计算细胞活性和半数抑制浓度(IC50)。3.流式细胞术检测Weel激酶抑制剂MK-1775对ALL细胞周期的影响：将Nalm-6和Jurkat细胞接种于6孔培养板中,加入OnM、100nM、300nM的MK-1775,继续培养24小时,PI染色,流式细胞术检测细胞DNA含量,ModFit LT软件计算细胞周期的变化。4. Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒检测细胞凋亡：ALL细胞系接种于6孔培养板中,加入不同浓度的MK-1775、阿霉素或者两者联合作用,培养24或48小时,收集细胞,Annexin V-FITC/PI染色,流式细胞术检测FITC/PI阳性细胞,Summit 5.2软件计算凋亡率。5. Western blot检测相关蛋白的表达：ALL细胞系接种于培养瓶中,分别加入一定浓度的MK-1775、阿霉素或者两者联合作用,继续培养24小时,收集细胞,提取蛋白质,用10%SDS-PAGE胶进行凝胶电泳,Western blot检测CDK1、p-CDK1、p-H3、PARP1、γH2AX、AKT、mTOR、p-mTOR、bcl-2、Notch1、 Hes1蛋白的表达。研究结果：1. Weel基因在ALL组和对照组的表达：Weel mRNA在ALL组的表达相对量=2-△Ct(ALL)=0.15±0.08,Well mRNA在对照组的表达相对量=2-△Ct(对照组)=0.09±0.05,ALL组表达高于对照组(p0.05)。2. Weel抑制剂MK-1775体外对细胞活性的影响：(1)MK-1775能抑制ALL细胞的活性,并且呈时间和浓度依赖性。培养48小时,Nalm-6、Molt-4、Jurkat、 Sup-T1细胞的MK-1775的IC50值分别为45.88±3.90 nM、67.60±31.80 nM、 137.39±33.99 nM、347.37±95.47nM。(2)MK-1775抑制HS-5的作用较弱,MK-1775作用48小时,IC50为1472.0±304.8 nM,分别高于四种ALL细胞,均有统计学差异(p0.05)。(3)MK-1775增加ADM的抗ALL活性。加药培养48小时,Nalm-6细胞单纯阿霉素作用组,阿霉素的ICso为0.058±0.017mg/ml,联合1OOnMMK-1775治疗组,阿霉素的ICso降为0.018±0.012mg/ml, p0.05; Jurkat细胞单纯阿霉素作用,阿霉素的IC50为0.044±0.017mg/ml,联合100nM MK-1775联合作用组,阿霉素的IC50降为和0.003±0.0005mg/ml, p0.05。3. Weel抑制剂MK-1775对细胞周期的影响：Nalm-6和Jurkat细胞培养板中加入0nM、1000nM、300nM的MK-1775,培养24小时,检测细胞周期。结果显示,Nalm-6细胞G1期比例分别为39.2+9.7%、34.8+5.0%(与对照比p0.05)和33.3+5.4%(与对照比p0.05),S期比例分别为55.1±7.7%、60.2±9.6%(与对照比p0.05)、61.4±17.2%(与对照比p0.05),G2/M期比例分别为3.3±2.0%、3.9±3.5%(与对照比p0.05)、7.2±9.0%(与对照比p0.05),与对照比,G1期、S期和G2/M期比值改变统计学无差异；Jurkat细胞G1期比例分别为42.54±4.1%、43.3±7.5%(与对照比p0.05)、15.64±3.5%(与对照比p0.05),S期比例分别为42.6±6.1%和43.34±7.5%(与对照比p0.05)、62.64±9.6%(与对照比p0.05),G2/M期比例分别为12.6±2.7%、14.0±3.4%(与对照比p0.05)和27.0±4.9%(与对照比p0.05),100nM MK-1775治疗与对照组相比,各期无明显变化,300nM治疗与空白对照相比,G1期比值下降,S期和G2/M期比值升高,有统计学差异。4. Weel抑制剂MK-1775对细胞凋亡的影响：(1)单药作用：ALL细胞分别与0nM、100nM、300nM的MK-1775培养48小时,流式细胞术检测结果显示凋亡率分别为3.46±2.25%、64.82±18.44%(与对照比p0.05)、88.83±7.65%(与对照比p0.05)：Jurkat细胞凋亡率分别为2.12±0.47%、41.26±12.30%(与对照比p0.05)、70.08±8.52%(与对照比p0.05)。不同浓度药物作用凋亡率均高于空白对照,且随MK-1775浓度升高而增高。 (2)联合作用：ALL细胞分别与空白药物、0.05mg/mlADM、1000nM的MK-1775、0.05mg/mlADM联合100nM的MK-1775作用24小时,流式细胞术检测凋亡。Nalm-6细胞凋亡率分别为2.30±1.13%、12.8±5.07%、17.15±7.89%、49.42±6.82%：Jurkat细胞凋亡率分别为3.01±1.31%、18.50±7.67%、23.25±10.87和67.16±7.67。结果显示Nalm-6和Jurkat细胞在两药联合作用时凋亡率均高于ADM和MK-1775单药作用以及空白对照组(p0.05)。5.MK-1775对信号蛋白表达的影响：Nalm-6和Jurkat细胞分别与空白药物、0.05mg/ml ADM、100nM的MK-1775、0.05mg/mlADM联合100nM的MK-1775作用24小时,western blot检测蛋白的表达。结果提示与空白对照组相比,MK-1775治疗组CDK1表达无明显变化,p-CDK1表达减低,p-H3表达增加,裂解的PARP1增加,γ-H2AX表达增加,Notchl和Hes1表达下降,AKT、mTOR、 p-mTOR、bcl-2蛋白无变化。阿霉素治疗组与对照相比,CDK1、p-CDK1、mTOR、 p-mTOR、Notch、Hes1、bcl-2均无明显变化,p-H3表达减低。两者联合作用,裂解的PARP1和γ-H2AX表达高于单药和对照组。结论：1. Weel基因在ALL患者中表达高于对照组,提示Weel在ALL发病中可能起着重要作用。2. Weel激酶抑制剂MK-1775体外具有抗ALL效应,呈时间和浓度依赖性,随着时间延长和浓度增高而增强；MK-1775对p53突变型和野生型ALL细胞均有效；MK-1775可增加阿霉素的抗ALL活性。3.与ALL细胞相比,MK-1775抑制骨髓基质细胞的作用较弱。4. Weel激酶抑制剂MK-1775通过抑制CDK1磷酸化干预G2/M检验点,促进细胞进入M期、抑制DNA修复、增加细胞损伤,诱发有丝分裂障碍。5. Weel激酶抑制剂MK-1775可能通过下调Notch1通路诱导细胞凋亡,而不依赖AKT-mTOR信号通路。6. Weel激酶抑制剂MK-1775是一种有应用前景的ALL治疗药物,联合治疗方案中可减少化疗药物用量,从而降低副作用。
【关键词】：Wee1 MK-1775 急性淋巴细胞白血病 阿霉素 Notch
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R733.71
【目录】：

• 中文摘要6-11
• 英文摘要11-15
• 符号说明15-17
• 前言17-21
• 材料与方法21-33
• 结果33-43
• 讨论43-48
• 结论48-49
• 附图49-51
• 参考文献51-61
• 致谢61-62
• 攻读学位期间发表的学术论文目录62-63
• 学位论文评阅及答辩情况表63-64
• 英文论文164-84
• 英文论文284-101
• 英文论文3101-108

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  本文关键词：Wee1激酶抑制剂MK-1775抗急性淋巴细胞白血病的效应及机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：258170