黑根霉菌丝体多糖结构表征及其抗肿瘤和免疫调节活性研究

发布时间：2017-03-21 12:10

  本文关键词：黑根霉菌丝体多糖结构表征及其抗肿瘤和免疫调节活性研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：恶性肿瘤严重威胁人类生命健康,已成为人类最主要的致死疾病之一。据全国肿瘤防治研究办公室的统计数据表明,我国每年新发癌症病例为350万,因癌症死亡的有250万。化学疗法是目前治疗癌症的重要手段之一,但是临床上的化疗药物在杀死癌细胞的同时也损伤了机体正常细胞的功能,导致严重的副作用,降低了患者的生存质量。此外,癌细胞对化疗药物易产生耐药性,常常导致化疗失败。因此,迫切需要寻找高效、低毒的新型肿瘤治疗药物。大量研究表明,多糖具有广泛的药理学活性,包括抗肿瘤、免疫调节、抗氧化、抗衰老等。其中,多糖的抗肿瘤和免疫调节活性研究受到越来越多的关注。多糖主要从两个方面发挥抗肿瘤作用：作为生物反应调节剂激活机体的免疫反应间接发挥抗肿瘤活性；通过引起细胞应激,调控肿瘤细胞中癌基因表达等诱导肿瘤细胞分化、凋亡、细胞周期阻滞,抑制肿瘤细胞的增殖和转移,发挥直接抗肿瘤作用。黑根霉Rhizopus nigricans是一种接合菌门丝状真菌,具有优异的生物转化功能,被广泛应用于食品和医药工业。研究发现,通过液体发酵获得的黑根霉菌丝体中含有大量活性多糖组分,具有良好的药理活性。本文以实验室分离保藏的一株黑根霉为材料,从其液体发酵菌丝中分离纯化活性多糖组分,研究其结构特征、抗肿瘤活性和免疫调节活性。以上研究旨在阐明黑根霉菌丝体多糖抗肿瘤活性和免疫调节活性的分子机制,为将其开发成为一种治疗或辅助治疗癌症的药物奠定基础。1.黑根霉菌丝体多糖的制备和结构表征采用水热浸提、乙醇沉淀、Sevag脱蛋白、D301R大孔树脂脱色,从黑根霉菌丝体中获得粗多糖。经Sephadex G-100凝胶柱层析,从粗多糖中分离获得黑根霉菌丝体多糖RPS,RPS的单糖组成和摩尔比为甘露糖：鼠李糖：葡萄糖醛酸：葡萄糖：半乳糖：岩藻糖=5.1：1.0：1.6：92.2：1.3：2.3。另外,采用DEAE-Sepharos Fast Flow阴离子交换凝胶层析和Sephacryl S-500 HR分子筛凝胶层析从粗多糖中分离纯化获得一种均一的水溶性非淀粉多糖,命名为RPS-1。高效尺寸排阻色谱联用多角度激光散射分析表明RPS-1的重均分子量为1.617×107g/mol,多分散系数为1.332,均方根旋转半径为24.2 nm。红外光谱结果显示RPS-1具有多糖的特征吸收峰。PMP柱前衍生化方法分析RPS-1的单糖组成,结果显示RPS-1只含有葡萄糖一种单糖。甲基化分析结果表明,RPS-1糖链中含有α-Glcp-(1→ α-Glcp-(1→和→4)--Glcp-(1→三种连接方式,摩尔比例为6.9：86.1：6.9。1HNMR核磁共振谱图的异头质子信号区域显示两个共振峰,δ5.35 ppm和4.92ppm分别归属为→4)-α-Glcp-(1→和α-Glcp-(1→的异头碳质子信号。13C NMR核磁共振谱图中,δ99.86 ppm为→4)-α-Glcp-(1→的C-1共振峰,且位于α-型糖苷异头碳的共振信号范围内。δ76.95 ppm为发生取代的C-4共振峰,δ60.58 ppm是葡萄糖残基的未取代的C-6共振峰,δ69.43 ppm是葡萄糖残基发生取代的C-6共振峰。根据以上结果我们推断,RPS-1是以→4)-α-D-Glcp(1→为主链并在其O-6位产生支链的非淀粉葡聚糖,平均每14.5个葡萄糖出现1个→4,6)-α-Glcp-(1→残基。2.黑根霉菌丝体多糖RPS的抗肿瘤活性研究多糖具有复杂的空间结构和多样的生物活性,可以在体外直接作用于肿瘤细胞,干扰细胞的新陈代谢、抑制其分裂增殖。本文研究了RPS对人胃癌BGC-823细胞的抗肿瘤活性,并初步探讨了其可能的作用机制。MTT结果显示,RPS处理12h、24、48h可以显著抑制BGC-823细胞生长。集落克隆实验结果显示,600μg/ml的RPS可以显著抑制BGC-823细胞集落形成,抑制率为70%。Hoechst33258染色、AO/EB染色和AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术分析结果显示,RPS诱导BGC-823细胞发生凋亡性细胞死亡。细胞周期分布检测结果显示,RPS可以阻滞肿瘤细胞于G2/M期。进一步的研究发现,RPS可以诱导BGC-823细胞线粒体膜电位的下降,提高细胞内活性氧含量。Caspase-9是线粒体凋亡通路的关键蛋白酶,位于线粒体通路中caspase瀑布式级联激活反应的顶端,600 μg/ml浓度的RPS处理组的caspase-9活性是对照组的1.72倍。PCR检测结果显示,RPS处理12h后,Bcl-2的nRNA的表达量随着RPS浓度的升高不断降低,然而Bax的mRNA表达量随着RPS浓度的升高不断增加。这些结果表明,RPS通过线粒体途径诱导人胃癌BGC-823细胞发生凋亡。我们还发现,RPS可以提高BGC-823细胞内游离钙离子浓度,上调GRP78、ATF6、CHOP和spliced-XBP1的mRNA表达水平,表明内质网应激可能也参与了RPS诱导BGC-823细胞凋亡。3.黑根霉菌丝体多糖RPS-1的免疫调节活性研究巨噬细胞是最重要的吞噬细胞和抗原呈递细胞之一,在机体免疫响应中发挥重要作用。因此,本文选择小鼠巨噬细胞RAW 264.7为材料,研究RPS-1的免疫调节活性。MTT检测结果表明,RPS-1在25-800 μg/ml浓度范围内对巨噬细胞没有细胞毒性。采用Griess法和ELISA分别测定NO和TNF-a的含量,结果表明RPS-1能显著促进巨噬细胞分泌NO和TNF-a,流式细胞术检测结果表明RPS-1可以增强巨噬细胞吞噬能力。。PMB可以特异性和内毒素结合,阻断其对巨噬细胞的刺激作用。PMB预处理不影响RPS-1刺激巨噬细胞分泌NO和TNF-a,说明RPS-1中不含内毒素污染。为了探明RPS-1激活巨噬细胞的信号通路和分子机制,我们采用免疫荧光染色、荧光素酶报告基因检测和western blot检测细胞内NF-κB、MAPk、Akt通路相关蛋白的表达。实验结果显示,RPS-1可以时间依赖性的诱导巨噬细胞内IκBα的降解和NF-κB p65的核移位,浓度依赖性的提高NF-κB转录活性。使用NF-κB通路特异性抑制剂BAY11-7082 (10μM)几乎完全抑制RPS-1诱导巨噬细胞分泌NO和TNF-a,表明NF-kB是参与RPS-1激活巨噬细胞的重要转录因子。我们还发现,RPS-1提高了p38、JNK、ERK和Akt的磷酸化水平。MAPK通路抑制剂PD98059(30μM)、SP600125(20μM)以及PI3K/Akt通路抑制剂LY294002(50μM)可以不同程度的抑制RPS-1诱导的NO和TNF-α分泌,然而p38通路抑制剂SB203580 (10μM)对RPS-1诱导的NO分泌没有影响。在不同的细胞类型和刺激因素下,MAPK通路和PBK/Akt通路之间存在着复杂的相互作用。我们发现,MAPK抑制剂预处理巨噬细胞30min后,RPS-1诱导的Akt磷酸化水平出现不同程度的下降,PBK/Akt抑制剂LY294002预处理可以明显降低JNK的磷酸化水平,但是对p38和ERK的磷酸化水平没有明显的影响,表明p-JNK和p-Akt在RPS-1激活巨噬细胞过程中存在着交互作用。RPS-1可以提高CT26结肠癌荷瘤小鼠的免疫器官指数、血清细胞因子含量和CD8+T淋巴细胞比例,抑制肿瘤生长,和5-FU联用还具有减毒增效的作用。综上所述,黑根霉菌丝体多糖RPS通过诱导线粒体途径细胞凋亡和G2/M期阻滞抑制人胃癌BGC-823细胞的增殖；黑根霉菌丝体多糖RPS-1是以→4)-α-D-Glcp(1→为主链并在其O-6位产生支链的非淀粉葡聚糖,可以通过NF-κB、MAPK和PI3K/Akt通路促进巨噬细胞分泌NO和TNF-α,提高CT26结肠癌荷瘤小鼠的免疫功能,抑制移植瘤生长,和5-FU联用还具有减毒增效的作用。
【关键词】：黑根霉 菌丝体多糖 结构表征 抗肿瘤 免疫调节
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R284;R285
【目录】：

• 摘要16-19
• Abstract19-24
• 本文缩略词24-26
• 第一章 绪论26-54
• 1. 多糖的免疫调节作用27-34
• 1.1 多糖对免疫器官的作用27-28
• 1.2 多糖对免疫细胞的作用28-30
• 1.2.1 多糖对巨噬细胞的作用28-29
• 1.2.2 多糖对淋巴细胞的作用29
• 1.2.3 多糖对树突状细胞的作用29-30
• 1.3 多糖受体及其信号转导30-34
• 1.3.1 Toll-like受体31-32
• 1.3.2 补体受体332
• 1.3.3 Dectin-1受体32-33
• 1.3.4 清道夫受体33
• 1.3.5 甘露糖受体33-34
• 2. 多糖的直接抗肿瘤作用34-41
• 2.1 多糖诱导肿瘤细胞发生凋亡34-38
• 2.2 多糖改变细胞膜的生化特性38-39
• 2.3 多糖抑制肿瘤转移39-41
• 2.4 多糖诱导肿瘤细胞周期阻滞41
• 3. 多糖的构效关系41-43
• 4. 多糖的研究方法43-52
• 4.1 多糖提取44-46
• 4.1.1 溶剂浸提法44
• 4.1.2 酶法提取44-45
• 4.1.3 微波和超声波辅助提取45
• 4.1.4 超高压提取法45
• 4.1.5 超临界萃取技术45-46
• 4.2 多糖分离纯化46-49
• 4.2.1 多糖的分离46-47
• 4.2.2 多糖的纯化47-49
• 4.3 多糖结构表征49-52
• 4.3.1 多糖纯度测定49
• 4.3.2 多糖分子量和分子尺寸49-50
• 4.3.3 单糖组成测定50
• 4.3.4 糖链结构的分析方法50-52
• 5. 本课题研究目的和意义52-54
• 第二章 黑根霉菌丝体多糖的制备和结构表征54-71
• 1. 实验材料与仪器54-56
• 1.1 菌株54
• 1.2 实验试剂54-55
• 1.3 实验仪器55-56
• 2. 实验方法56-60
• 2.1 黑根霉的培养56
• 2.2 黑根霉菌丝体多糖的制备56-57
• 2.3 理化性质分析57-58
• 2.3.1 碘-碘化钾反应57
• 2.3.2 总糖含量的测定57
• 2.3.3 紫外检测57-58
• 2.4 高效尺寸排阻色谱联合多角度激光光散射分析58
• 2.5 单糖组成分析58-59
• 2.5.1 多糖水解58
• 2.5.2 柱前衍生条件58-59
• 2.5.3 色谱条件59
• 2.5.4 标准曲线的绘制59
• 2.6 红外光谱分析59
• 2.7 甲基化分析59-60
• 2.8 核磁共振波谱分析60
• 3. 实验结果与分析60-70
• 3.1 黑根霉菌丝体多糖的制备60-62
• 3.2 黑根霉菌丝体多糖的理化性质分析62
• 3.3 黑根霉菌丝体多糖的单糖组成分析62-64
• 3.4 黑根霉菌丝体多糖的高效尺寸排阻色谱-多角度激光散射分析64-65
• 3.5 黑根霉菌丝体多糖的红外光谱测定结果65-66
• 3.6 黑根霉菌丝体多糖的甲基化分析66-69
• 3.7 黑根霉菌丝体多糖的核磁共振分析结果69-70
• 4. 小结70-71
• 第三章 黑根霉菌丝体多糖RPS的抗肿瘤活性研究71-88
• 1. 实验材料与仪器72-73
• 1.1 细胞株72
• 1.2 实验试剂72-73
• 1.3 实验仪器73
• 2. 实验方法73-79
• 2.1 细胞培养73-74
• 2.2 细胞增殖活性检测74
• 2.3 细胞周期检测74
• 2.4 细胞形态学观察74-75
• 2.4.1 AO/EB染色74
• 2.4.2 Hoechst 33258染色74-75
• 2.5 细胞凋亡检测75
• 2.6 线粒体膜电位检测75-76
• 2.7 活性氧检测76
• 2.8 钙离子浓度检测76
• 2.9 基因表达检测76-79
• 2.9.1 总RNA的提取76-77
• 2.9.2 cDNA的合成77
• 2.9.3 引物的设计77-78
• 2.9.4 PCR和实时荧光定量PCR分析78-79
• 2.10 统计学处理79
• 3. 实验结果与分析79-87
• 3.1 RPS的体外抗肿瘤活性筛选79-80
• 3.2 RPS诱导BGC-823细胞发生G2/M期周期阻滞80-81
• 3.3 RPS诱导BGC-823细胞发生线粒体途径凋亡81-85
• 3.3.1 RPS对BGC-823细胞凋亡的影响81-83
• 3.3.2 RPS诱导BGC-823细胞线粒体膜电位下降83-84
• 3.3.3 RPS提高BGC-823细胞内活性氧含量和游离钙离子浓度84
• 3.3.4 RPS激活BGC-823细胞内caspase-9和caspase-384-85
• 3.3.5 RPS对Bcl-2和Bax基因表达的影响85
• 3.4 RPS诱导BGC-823细胞发生内质网应激85-87
• 4. 小结87-88
• 第四章 黑根霉菌丝体多糖RPS-1的免疫调节活性研究88-111
• 1. 实验材料与仪器88-91
• 1.1 细胞株88-89
• 1.2 实验动物89
• 1.3 实验试剂89-90
• 1.4 实验仪器90-91
• 2. 实验方法91-97
• 2.1 细胞培养91
• 2.2 细胞增殖活力检测91
• 2.3 吞噬能力检测91
• 2.4 一氧化氮测定91
• 2.5 酶联免疫吸附法测定细胞因子含量91-92
• 2.6 蛋白提取92-93
• 2.6.1 细胞总蛋白提取92
• 2.6.2 细胞核蛋白和细胞浆蛋白提取92-93
• 2.7 免疫印迹93
• 2.8 荧光素酶报告基因实验93-96
• 2.8.1 质粒转化和提取93-95
• 2.8.2 基因转染95
• 2.8.3 荧光素酶活性检测95-96
• 2.9 荷瘤小鼠模型构建96
• 2.10 肿瘤抑制率、脾指数及胸腺指数的测定96-97
• 2.11 CD8~+T淋巴细胞分析97
• 2.12 统计学处理97
• 3. 实验结果与分析97-110
• 3.1 RPS-1对RAW 264.7细胞增殖的影响97
• 3.2 RPS-1提高RAW 264.7细胞的吞噬活性97-98
• 3.3 RPS-1促进RAW 264.7细胞分泌一氧化氮和肿瘤坏死因子98-101
• 3.4 RPS-1激活NF-κB、MAPK和PI3K/Akt通路101-104
• 3.5 MAPK、PI3K/Akt和NF-κB通路在RPS-1激活巨噬细胞过程中发挥的作用104-105
• 3.6 MAPK和PI3K/Akt通路的相互作用105-106
• 3.7 RPS-1对荷瘤小鼠肿瘤生长、免疫器官指数和体重的影响106-109
• 3.8 RPS-1对荷瘤小鼠血清中细胞因子含量的影响109
• 3.9 RPS-1对荷瘤小鼠脾脏中CD8~+T淋巴细胞比例的影响109-110
• 4. 小结110-111
• 第五章 讨论111-116
• 参考文献116-131
• 致谢131-132
• 攻读学位期间发表的学术论文132-133
• 附件133-150
• 附表150

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 郭振军;刘莉;张维璐;王东琳;李永明;孙阳;李倩;李晨;梅其炳;;大黄、当归多糖对巨噬细胞甘露糖受体作用的研究[J];细胞与分子免疫学杂志;2008年05期

2 严薇;任敏;姚文兵;金磊;高向东;;海洋真菌多糖YCP的酶法降解及其产物分析[J];中国药科大学学报;2010年01期

  本文关键词：黑根霉菌丝体多糖结构表征及其抗肿瘤和免疫调节活性研究，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：259645