调控干细胞能量代谢在体构建小口径组织工程血管

发布时间：2017-03-21 21:08

  本文关键词：调控干细胞能量代谢在体构建小口径组织工程血管，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：在过去三十年中,心脑血管疾病始终是我国城乡居民的首位死因。尽管近些年来由于药物的使用以及介入技术的发展,部分心脑血管事件的死亡率得到了控制。但是,最终越来越多的病人仍然需要进行血管置换手术或心脏搭桥手术,这些手术都需要血管替代物。此外,血管替代物在肿瘤、外伤、炎症引起的血管病变、动脉瘤、动脉夹层以及血液透析等方面也有着巨大的临床需求。临床上,血管替代物主要来源于自体血管或人工血管。使用自体血管移植存在以下问题:1.自体血管数量有限,疾病状态下的自体血管质量不高;2.在取供体血管时会造成局部创伤,增加了手术时间以及病人的负担。而现阶段应用于临床的人工血管主要为涤纶或不可降解的高聚合物,这类人工血管不仅需要长期的抗凝药物支持,而且作为异物不能被机体吸收,弹性较差。它们仅可应用于大口径血管的替换。而针对小口径(直径6mm)的血管替换,还没有可应用于临床的血管移植物产品。因此,研发新型的小口径人工血管迫在眉睫。现有实验研究表明,小于6mm的人工血管长期通畅率很低。影响小口径人工血管通畅率的主要因素为1.急性血栓;2.内膜增生导致的管腔狭窄。血管移植物移植后直接接触血液,作为异物很容易与血液相互作用形成血栓。因此,避免急性血栓形成是维持血管移植物早期通畅的关键。而内膜增生是由各种原因引起的血管移植物内的平滑肌异常增殖以及细胞外基质的沉积而导致的血管内膜层增厚。内膜增生是致使血管晚期堵塞的重要原因。在正常血管的表面覆盖有内皮层,其对防止血栓形成和维持血管的稳态有着重要作用。对于人工血管来说,在其血管内腔内皮化越早,血小板聚集、血栓形成的风险就会越小。人工血管的内皮化同样会对后期内膜异常增生起到抑制作用。因此促进内皮化是人工血管维持通畅的关键。目前的研究发现,人工血管的内皮化主要涉及以下机制,吻合口附近内皮细胞越过吻合口向组织工程血管爬行,以及循环内皮祖细胞迁移归巢至血管表面形成内皮层。由于吻合口两端的内皮细胞爬行的距离很有限,因此血管移植物中段的内皮化主要由内皮祖细胞的迁移、归巢、分化完成。在正常人体内,内皮祖细胞主要参与血管内衰老细胞的更换,归巢并修复损伤部位,维持血管稳态。内皮祖细胞不仅能直接分化成为内皮细胞,还可以分泌生长因子促进附近内皮细胞生长以及血管再生。内皮祖细胞的归巢对于血管移植物的内皮化具有重要的意义。因此,如何让内皮祖细胞更快的归巢到组织工程血管表面,更快更好的发挥其功能是本研究的重点。近些年来,关于干细胞能量代谢的研究与日俱增。研究发现,增加干细胞的有氧代谢水平可以有效的促进干细胞功能的发挥。因此我们猜测,是否增强内皮祖细胞的代谢状态会改善其功能,并进一步促进组织工程血管的内皮化。一磷酸腺苷激活的蛋白激酶(adenosinemonophosphateactivatedproteinkinase,ampk)是能够感知细胞内能量代谢状况的蛋白激酶。当其感受到细胞处于能量需求状态时会激活,从而激发其下游的信号通路,促进分解代谢,抑制合成代谢,增加细胞内atp的产生。5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸(5-aminoimidazole-4-carboxamide1-β-d-ribofuranoside,aicar)是一种常用的的ampk的激动剂,并已经是一种被批准应用于临床的药物。在此,我们使用aicar来改善干细胞的代谢状态,来评价其对内皮祖细胞功能的影响,并构建搭载aicar纳米微球的组织工程血管,建立大鼠颈动脉移植模型,观察其对内皮化以及通畅率的影响。此外,糖尿病在全球有着极高的发病率,而糖尿病血管病变是糖尿病并发症中普遍存在并且严重的并发症之一。其血管移植术后,病理状态下参与血管移植物内皮化的细胞的功能会减弱,血管移植物更容易发生病变以及堵塞。因此,应用于糖尿病病人的血管移植物需要更好的生物相容性并拥有抵抗体内病理条件的功能。而针对参与血管移植物再生的干细胞功能,在病理情况下会发生怎样改变的研究也较少。我们的组织工程血管在糖尿病模型中效果如何,尚不清楚。因此,通过在高糖情况下使用aicar刺激内皮祖细胞,改变其代谢功能,并观察对内皮祖细胞功能的影响,以及对内皮祖细胞促组织再生功能的影响。再将aicar修饰的组织工程血管应用于糖尿病模型,进一步验证我们的假说。我们认为基于促进干细胞代谢的组织工程血管的研究可以为未来血管移植物的构建提供新的思路。我们对如下几个方面进行研究1aicar对组织工程血管种子细胞的功能影响首先,我们通过罗丹明123,线粒体染色以及细胞内atp的检测发现aicar可以明显促进内皮祖细胞代谢状态。通过平板流动腔实验模拟体内血流状态发现代谢功能增强的内皮祖细胞可以更多的归巢到血管表面。而通过transwell和elisa吸附试验(enzymelinkedimmunosorbentassay,elisa)实验验证,代谢功能增强的内皮祖细胞的迁移功能以及旁分泌功能同样被增强了。我们认为,通过aicar刺激,内皮祖细胞的代谢状态被增强,并进一步促进了内皮祖细胞功能。而增强功能的内皮祖细胞对工程血管的内皮化及血管稳态具有重要作用。此外,我们还对参与组织工程血管再生的其它细胞进行了研究。结果显示aicar可以同抑制血小板五羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-ht)和血栓素a2(thromboxanea2,txa2)的分泌,维持血小板的适度聚集,促进吻合口附近的内皮细胞的爬行,并通过g1期聚集抑制病理性平滑肌增殖,分泌功能,促进平滑肌能量代谢、自噬、分化以及正常的生理功能。2aicar修饰的组织工程血管的构建为了验证是否aicar可以通过增强内皮祖细胞的代谢和功能以及其它影响参与血管再生的细胞功能,进而促进组织工程血管的内皮化和通畅率,我们构建了aicar修饰的组织工程血管。通过对sd(sprague-dawley)大鼠颈动脉进行脱细胞处理后,去除其细胞成分,保留支架部分。这样的血管支架拥有优秀的生物相容性,以及力学强度。通过离子交换法制备包裹aicar的纳米微球颗粒,使aicar具有缓释功能。再将纳米颗粒与胶原混合后与上述血管支架交联,构成aicar修饰的组织工程血管。通过缓释实验,力学测试和毒性检测,验证组织工程血管适合应用于移植模型。接下来,通过显微外科的技术手段,将制备好的组织工程血管移植到sd大鼠的颈动脉中段。通过在不同时间点的取材切片观察,发现aicar修饰的组织工程血管通畅率远远高于对照组,内皮化和再生速度明显加快。我们认为aicar可以通过促干细胞的代谢和功能,加快工程血管的内皮化,增加血管的通畅率。3aicar在高糖状态下改善内皮祖细胞能量代谢及功能。进一步我们在高糖情况下对内皮祖细胞进行培养并做功能检测。通过罗丹明123,线粒体染色,细胞内三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate,atp)以及更为精确的细胞耗氧量检测,我们发现aicar可以明显改善高糖状态下较差的内皮祖细胞代谢状态,逆转高糖对内皮祖细胞代谢功能的损伤。aicar还可以改善组细胞增加高清情况下内皮祖细胞的葡萄糖吸收,增加能量摄取,并减少局部的糖浓度。在自噬检测中我们也发现aicar可以促进内皮祖细胞的自噬产生。这对于高糖情况下,维持高糖损伤后的内皮祖细胞稳态具有重要的意义。而通过elisa,transwell实验也验证了,受损的内皮祖细胞的旁分泌,迁移功能在aicar处理后得到了恢复和增强。上述结果说明,aicar可以逆转高糖对于内皮祖细胞的代谢和功能损害,而恢复的内皮祖细胞功能会对糖尿病组织工程血管的内皮化起到促进作用。4aicar修饰的组织工程血管在糖尿病模型中的应用内皮祖细胞在糖尿病大血管病变以及微血管病的形成、修复中都有重要的作用。为了进一步验证增强代谢对内皮祖细胞修复功能的作用,我们在糖尿病小鼠缺血性下肢溃疡模型中进行了在体实验。我们发现AICAR预处理后的内皮祖细胞或糖尿病内皮祖细胞均比未处理的内皮祖细胞在糖尿病溃疡组织中有着更好的细胞存活率,微血管生成和组织修复率。而AICAR预处理的AMPKa2-/-小鼠的内皮祖细胞相比于C57BL/6J小鼠内皮祖细胞,则有着更低的细胞存活率,微血管生成和组织修复率。因此我们认为AICAR可以通过AMPK通路,改善内皮祖细胞在糖尿病病患体内的存活率以及血管再生功能。进一步,我们构建了糖尿病大鼠颈动脉移植模型。通过3个月的观察,AICAR修饰的组织工程血管仍然具有较高的通畅率。而研究证明一些应用于非糖尿病模型中具有高通畅率的组织工程血管,在糖尿病模型移植术后的通畅率却不尽如人意。此外,我们还发现相比与非糖尿病模型,糖尿病模型中组织工程血管的细胞化的速度明显减慢。综上所述,本论文通过多个动物模型的构建以及体外实验证明,通过模式分子AICAR的刺激增强或改善的内皮祖细胞代谢状态,会促进内皮祖细胞的归巢、迁移、旁分泌等功能,逆转高糖对内皮祖细胞功能的损害,进而加速组织工程血管的早期内皮化,增加小口径组织工程血管的远期通畅率。
【关键词】：AICAR 内皮祖细胞 组织工程血管 内皮化 能量代谢 糖尿病
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R54;R318.11
【目录】：

• 缩略语表5-8
• Abstract8-13
• 中文摘要13-17
• 第一章 前言17-20
• 第二章 AICAR对组织工程血管种子细胞的代谢及功能影响20-49
• 2.1 材料与方法20-32
• 2.2 结果32-46
• 2.3 讨论46-48
• 2.4 小结48-49
• 第三章 AICAR修饰的组织工程血管的构建49-66
• 3.1 材料与方法49-55
• 3.2 结果55-63
• 3.3 讨论63-65
• 3.4 小结65-66
• 第四章 AICAR在高糖状态下改善内皮祖细胞能量代谢及功能66-83
• 4.1 材料和方法66-73
• 4.2 结果73-81
• 4.3 讨论81-82
• 4.4 小结82-83
• 第五章 AICAR修饰的组织工程血管在糖尿病模型中的应用83-98
• 5.1 材料与方法83-88
• 5.2 结果88-96
• 5.3 讨论96-97
• 5.4 小结97-98
• 全文结论98-99
• 参考文献99-111
• 文献综述 组织工程血管支架材料111-126
• 参考文献118-126
• 攻读博士学位期间发表论文情况126-128
• 致谢128

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本文编号：260296