探讨海珠益肝加味方对免疫性肝损伤小鼠肠—肝轴及肠道菌群的干预作用

发布时间：2017-03-22 03:13

  本文关键词：探讨海珠益肝加味方对免疫性肝损伤小鼠肠—肝轴及肠道菌群的干预作用，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:本研究基于对中医经典理论“肝脾同治”以及现代医学“肠-肝轴”学说的充分认识,探讨海珠益肝加味方对Con A(Concanavalin A,刀豆蛋白A)诱导的慢性免疫性肝损伤小鼠肝脏Toll样受体信号转导通路及肠道功能的影响,探明慢性免疫性肝损伤与肠黏膜功能、内毒素水平以及肠道菌群间的关系,明确肠道功能在慢性肝炎发生、发展中的作用。本实验通过分析这一过程中所涉及的关键信号通路,进一步揭示“肝脾同治”和“肠-肝轴”的科学内涵,为慢性乙型肝炎的防治提供新思路和新策略。方法:小鼠48只,随机分为4组,空白对照组、模型组、甘草酸二铵组、海珠益肝加味方组各12只。模型组、甘草酸二铵组、海珠益肝加味方组采用6mg·kg-1 w-1的剂量尾静脉注射Con A,共6周,复制慢性免疫性肝损伤模型。模型复制后甘草酸二铵组小鼠以甘草酸二铵0.68g·kg-1d-1的剂量灌胃给药,海珠益肝加味方组小鼠以海珠益肝加味方15.17g·kg-1d-1的剂量灌胃给药,空白对照组及模型组予以等剂量的蒸馏水灌胃,每日9a.m.和3p.m.分两次灌胃,连续4周。灌胃给药结束后,当日夜间禁食,次日清晨采集各组小鼠粪便标本,继而采集血液和肝脏、回肠等组织标本。测定各组小鼠血清ALT(alanine aminotransferase,丙氨酸氨基转移酶)、AST(aspartate aminotransferase,天门冬氨酸氨基转移酶)和TBIL(total bilirubin,总胆红素)水平;取肝脏组织作病理学切片,进行HE染色评定肝组织病损积分;取回肠组织作病理学切片,进行HE染色在光学显微镜下观察各组小鼠肠黏膜病损情况;以电子显微镜对各组小鼠肝组织进行超微病理学观察;ABC-ELIASA法检测血清中TNF-α(tumor necrosis factor-α,肿瘤坏死因子-α)、IL-6(interleukin-6,白细胞介素-6)及LBP(LPS binding protein,脂多糖结合蛋白)的水平;鲎试剂显色基质法测定血浆内毒素水平;Western blot(免疫印迹试验)法检测小鼠肝组织中tlr4(toll-likereceptor-4,toll样受体4)、myd88(myeloidddifferentiationfactor88,髓样分化因子-88)、nf-κb(nuclearfactor-k-genebinding,基因结合核因子)蛋白表达;realtime-pcr检测小鼠肝脏组织中tlr4mrna、myd88mrna、nf-κbmrna以及肠道关键菌群--enco(enterococcus,肠球菌)、e.coli(enterobacteriaceae,肠杆菌)、bifi(bifidobacterium,双歧杆菌)、lacto(lactobacillus,乳酸杆菌)的含量。结果:1.alt、ast、tbil情况:与空白对照组比较,模型组、甘草酸二铵组、海珠益肝加味方组小鼠血清alt、ast、tbil水平均升高(p均0.05);与模型组比较,甘草酸二铵组、海珠益肝加味方组血清alt、ast、tbil水平均降低(p均0.05);与甘草酸二铵组比较,海珠益肝加味组在降低小鼠血清tbil水平方面优于甘草酸二铵(p0.05),但alt下降水平不及甘草酸二铵组(p0.05),两组ast水平未见明显差异(p0.05)。2.病理组织学变化:光学显微镜下显示,模型组小鼠肝脏淤血,汇管区大量的淋巴细胞浸润,肝板消失,肝细胞排列紊乱;与模型组比较,甘草酸二铵组和海珠益肝加味方组在减轻肝组织病损积分方面差异有统计学意义(p0.05)。在肝脏超微结构上,模型组肝细胞核固缩,胞膜形态不完整,胞质疏松,线粒体肿胀,嵴模糊,内质网扩张;甘草酸二铵组和海珠益肝加味方组在以上方面均较模型组有所改善。小鼠回肠组织病理学显示,模型组小鼠回肠黏膜固有层变薄,上皮细胞变性脱落,绒毛水肿,排列紊乱,淋巴细胞浸润增多;甘草酸二铵组和海珠益肝加味方组在以上方面均较模型组有显著改善。3.tnf-α、il-6的表达:模型组、甘草酸二铵组、海珠益肝加味方组小鼠血清中tnf-α、il-6水平明显高于空白对照组(p0.05);与模型组比较,甘草酸二铵组小鼠血清tnf-α水平下降(p0.05),而il-6水平明未见明显差异(p0.05);与模型组比较,海珠益肝加味方组tnf-α、il-6水平均下降,差异有统计学意义(p均0.05)。与甘草酸二铵组比较,海珠益肝方加味组il-6水平下降(p0.05),tnf-α水平未见差异(p0.05)。4.内毒素、lbp水平:与空白对照组比较,模型组、甘草酸二铵组小鼠内毒素和lbp水平明显升高(p均0.05);与模型组比较,甘草酸二铵组小鼠内毒素和lbp水平未见明显差异(p均0.05);与模型组比较,海珠益肝加味方组lbp和内毒素水平均降低(p均0.05)。与甘草酸二铵组比较,海珠益肝方加味组小鼠血浆lbp、lps水平降低(p均0.05)。5.肝组织tlr4-myd88-nf-κb通路的蛋白表达及转录水平:模型组肝组织tlr4、myd88、nf-κb的蛋白表达和mrna转录水平均明显升高(p均0.05);与模型组比较,甘草酸二铵组,tlr4、myd88、nf-κb蛋白表达和mrna转录水平下降(p均0.05);与模型组比较,海珠益肝加味方组肝组织tlr4、myd88、nf-κb的蛋白表达和mrna转录水平均下降(p0.05)。与甘草酸二铵组相比,海珠益肝加味方组myd88蛋白表达水平及tlr4、nf-κbmrna转录水平下降(p均0.05),余未见统计学意义(p均0.05)。6.肠道菌群水平:模型组小鼠肠道菌群中双歧杆菌、乳酸杆菌数量较空白对照组下降,而肠杆菌、肠球菌的数量增加(p0.05);在甘草酸二铵的干预下肠杆菌、肠球菌的数量较模型组降低(p0.05);在海珠益肝加味方的干预下肠杆菌、肠球菌的数量较模型组降低,双歧杆菌、乳酸杆菌数量增加(p0.05)。与甘草酸二铵组相比海珠益肝加味方组小鼠肠道菌群中双歧杆菌数量增加,肠杆菌、肠球菌的数量下降(p0.05)。结论:以“肝脾同治”为法的海珠益肝加味方在降低转氨酶(alt、ast)和胆红素(tbil)方面具有良好作用。同时海珠益肝加味方能够减轻肝组织和回肠组织的病理损伤程度,其抗慢性免疫性肝损伤的作用机制可能为:1.海珠益肝加味方可能是通过抑制tlr4、myd88和nf-κb的表达,从而调控tlr4-myd88-nf-κb信号通路,降低tnf-α、il-6水平,减少促炎因子的过度刺激,以减轻过度的免疫反应,从而起到抗肝损伤的作用。2.海珠益肝加味方通过改善肝损伤小鼠的肠道病理损伤,保护肠黏膜屏障及调节肠道菌群,减少机会致病菌产生内毒素,从而降低小鼠血浆内毒素水平,并通过降低内毒素配体LBP水平,对内毒素生物学效应起到明显阻断作用,故海珠益肝加味方可在一定程度上减轻由肠道损伤所加重的肝脏损伤。
【关键词】：免疫性肝损伤 肠-肝轴 肠道菌群 肝脾同治 海珠益肝加味方
【学位授予单位】：湖北中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R285.5
【目录】：

• 中文摘要6-10
• Abstract10-16
• 中英文缩略词表16-18
• 前言18-20
• 材料方法20-43
• 1 材料20-24
• 2 方法24-25
• 2.1 动物分组24
• 2.2 模型复制和给药24-25
• 3 观察指标25-42
• 3.1 动物的一般情况25
• 3.2 光、电镜观察小鼠肝、回肠组织25-28
• 3.3 血清转氨酶及胆红素水平测定28
• 3.4 双抗体夹心ELISA法测定小鼠血清IL-6、TNF-α、LBP水平28-29
• 3.5 鲎试剂显色基质法测定小鼠血浆内毒素水平29-30
• 3.6 Western blot测定小鼠肝组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达30-35
• 3.7 Real Time-PCR测定小鼠肝组织TLR4mRNA、MyD88 mRNA、NF-κBmRNA转录水平35-38
• 3.8 16SrDNA荧光定量PCR测定小鼠肠道菌群水平38-42
• 4 统计学方法42-43
• 结果分析43-57
• 1 动物的一般情况43-44
• 2 肝脏、回肠病理组织学观察44-47
• 3 海珠益肝加味方对小鼠血清ALT、AST、TBIL的影响47
• 4 海珠益肝加味方对小鼠血清IL-6、TNF-α水平的影响47-48
• 5 海珠益肝加味方对小鼠LPS及LBP水平的影响48-49
• 6 各组小鼠肝组织TLR4、MyD88、NF-κB的蛋白表达水平49-51
• 7 小鼠肝组织TLR4mRNA、MyD88 mRNA、NF-κB mRNA转录水平51-54
• 8 各组小鼠肠道菌群水平54-57
• 讨论57-80
• 1 慢性免疫性肝损伤动物模型的复制57-58
• 1.1 模型的选择57-58
• 1.2 模型的评价58
• 2 对于慢性乙型肝炎病机的再认识58-61
• 3 海珠益肝加味方方解61-65
• 3.1 海珠益肝加味方的前期研究基础61-62
• 3.2 海珠益肝加味方的组方原则62-65
• 4 海珠益肝加味方的保肝降酶退黄作用65-67
• 4.1 海珠益肝加味方的保肝降酶作用65-66
• 4.2 海珠益肝加味方的降酶退黄作用66-67
• 5 海珠益肝加味方对“肠-肝轴”的影响67-74
• 5.1 海珠益肝加味方对内毒素的影响68-70
• 5.2 海珠益肝加味方对TLR4-MyD88-NF-κB通路的影响70-72
• 5.3 海珠益肝加味方对细胞因子的影响72-74
• 6 海珠益肝加味方对小鼠肠黏膜及肠道菌群的影响74-77
• 6.1 海珠益肝加味方对小鼠肠黏膜的影响74-76
• 6.2 海珠益肝加味方对小鼠肠道菌群的影响76-77
• 7 存在的问题及下一步研究方向77-80
• 7.1 关于慢性免疫性肝损伤小鼠的辩证问题78
• 7.2 关于研究可拓展方向的思考78-80
• 结语80-81
• 参考文献81-96
• 附录96-110
• 1 文献综述96-107
• 参考文献103-107
• 2 附图107-109
• 3 博士期间参与课题和发表论文情况109-110
• 致谢110

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