HIF-1alpha对周期性张应力诱导的大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的作用研究

发布时间：2017-03-27 18:15

  本文关键词：HIF-1alpha对周期性张应力诱导的大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景和目的经典正畸学牙齿移动的组织学变化是：外力作用在牙周组织产生压力侧和张力侧；牙周膜压力侧牙周间隙变窄,血流量减少,胶原纤维和基质降解吸收,破骨细胞分化,牙槽骨吸收；牙周膜张力侧牙周间隙变宽,血流量增多,胶原纤维和基质增生,成骨细胞分化,新生牙槽骨沉积。临床上,正畸矫治力作用于牙齿引起牙周组织变化,造成牙槽骨改建,最终使牙齿发生移动。因此,骨改建是正畸牙齿移动的生物学基础,也是正畸治疗的依据。在这个过程中,成骨细胞的活动在骨改建中处于“中心调控地位”,是正畸牙齿移动的生物学基础,但其在体内无增殖分化能力,在发育完成后主要来源于机体内的骨髓问充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells, BMSCs)储备。BMSCs在正畸力的作用下可分化为成骨细胞,同时也可诱导生成破骨细胞,分别实现牙槽骨的沉积与吸收,进行牙周骨组织的重建。因此,以骨髓间充质干细胞为研究对象是进一步探索正畸牙移动机制的有效途径,深入研究应力对其成骨分化的调控及其机制,可能会给正畸牙周骨组织修复重建提供新的思路。生长的微环境对其分化和表型的表达十分重要,以往的研究多集中在生物化学环境,对于生物力学环境的研究尚在起步阶段。细胞在生物体内受到各种生理应力而发生相应的生物学变化,然而,由于体内环境的复杂性,在生物体内研究力学因素对细胞行为的影响就难以分辨是单一因素还是联合作用。因此,系统研究生物力刺激对细胞的影响主要依赖于体外加力装置,在目前研究较多的生物力形式中,张应力是决定细胞功能和形变的主要因素。不同的张应力可导致所有的细胞骨架发生整体构架重排,继而发生细胞形变,发出信息,并向细胞核内传递信息,从而产生了不同效应。因此,张应力更能真实模拟体内细胞受力的微环境,使体外培养的细胞的生长状态更接近于体内环境。骨髓间充质干细胞分离于低氧环境下的骨髓(含氧1～7%),缺氧诱导因子-1 alpha (hypoxia-inducible factor 1 alpha, HIF-1 alpha)是低氧适应病理反应中的一个特异的调节因子和缺氧诱导条件下基因转录过程中信息传递的共同通路。在机体适应缺氧环境的过程中,HIF-1 alpha起着关键的作用。正畸过程中施加的机械力在牙槽骨和牙根之间造成局部的缺氧环境,而局部微环境缺氧是启动骨改建的重要因素之一。然而,力环境下HIF-1 alpha对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响是一个重要研究课题,其作用机理不明,国内外尚无相关报道。综观此领域的现有工作：目前关于周期性张应力介导下HIF-1 alpha对骨髓间充质干细胞成骨分化的作用的研究还很不充分,对周期性张应力介导下HIF-1 alpha对骨髓间充质干细胞成骨分化的作用机理的阐述有利于指导临床医生采用不同的手段和方法调控或诱导骨改建,对临床干预具有重要的指导意义,这正是实现正畸牙齿最优化移动亟需解决的问题。本研究首先拟建立大鼠单侧上颌正畸牙齿移动模型,体内实验检测HIF-1alpha在受力区域的表达变化,研究牵张环境下牙槽骨中HIF-1 alpha的表达水平；同时进行大鼠骨髓间充质干细胞的原代培养,构建骨髓间充质干细胞体外培养-力学刺激模型,施加相同频率,不同力值大小和持续时间的动态张应力刺激,根据张应力力值和时间与大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化之间的关系,筛选出促进骨髓问充质干细胞成骨分化的最适张应力；并在此基础上,采用慢病毒包装质粒构建沉默表达HIF-1 alpha的稳定细胞系,对其施以最适成骨的张应力刺激,研究HIF-1 alpha在周期性张应力介导的大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化中的作用,并推测其可能的调控机制;明确力、HIF-1 alpha、大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化三者之间的关系。本课题试图阐明力学因素在调控大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的重要作用,从细胞力学角度揭示HEF-1 alpha在大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的作用机制,为临床正畸矫治提供理论依据。主要实验方法及结果1.观察牵张力环境下牙槽骨中HIF-1 alpha的表达变化：成功地建立大鼠上颌单侧正畸牙移动模型,分别在未加力、加力1d、3d、7d、14d、28d时,处死大鼠,经组织固定、脱钙后,制作上颌右侧第一磨牙牙周组织切片,行HE染色观察其牙周组织形态学变化,免疫组织化学进行半定量分析HIF-1 alpha和其下游基因VEGF的表达。本实验发现在正常大鼠的牙周组织中基本上未见有明显的HIF-1 alpha的阳性表达,其下游靶基因VEGF表达也较弱;在正畸加力组中可见HIF-1 alpha的表达增强,并且表达强度变化贯穿正畸牙周组织改建的全过程,靠近牙骨质和牙槽骨表面的牙周膜区域强阳性表达,中间部分的牙周膜也呈阳性表达;VEGF表达虽不如HIF-1 alpha的强,但也随加力时间延长有增强趋势。从而确定HIF-1 alpha参与了大鼠牙齿移动过程中牙周组织的改建,在正畸牙移动的机制中具有重要意义。2.大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养和鉴定：将全贴壁法分离的大鼠骨髓间充质干细胞通过体外分离培养、传代扩增的方式获得原代大鼠BMSCs。对细胞进行了形态学检验,MTT法检测其增殖能力,LIVE/DEAD法检测细胞的活力,有限稀释法结晶紫染色证明其克隆形成能力；并将细胞分别用成骨诱导液及成脂诱导液培养,通过茜素红染色、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, ALP)染色及油红O染色证明其多向分化能力。从而对得到的大鼠BMSCs进行细胞活性及干性的鉴定。3.确定最适体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的周期性张应力条件：成功的构建了大鼠骨髓间充质干细胞体外培养-周期性张应力加载力学刺激模型,并将细胞分为不加力组和加力组,其中加力组按1%、5%、15%的不同作用力值,以及0.5h、2h、6h、8h、12h的不同持续时间分为15组,分别施加周期性张应力,作用力频率均为1Hz。加力结束后对细胞进行ALP碱性磷酸酶活性检测,根据OD值筛选出最适宜大鼠BMSCs成骨分化的加力条件为1Hz频率、5%拉伸强度,并加载6h。4.观察周期性张应力加载下大鼠骨髓间充质干细胞内HIF-1 alpha在mRNA和蛋白水平的表达变化：在体外培养的大鼠BMSCs内HIF-1 alpha表达很弱,但经周期性张应力刺激可促进其在mRNA和蛋白水平的表达,且随加力时间延长表达增强,mRNA水平表达变化与蛋白水平表达变化呈现较为一致的趋势。表明HIF-1 alpha可对力学刺激做出阳性表达反应。5.稳定沉默表达HIF-1 alpha的大鼠骨髓间充质干细胞的构建及鉴定：本实验首先根据大鼠HIF-1 alpha基因序列设计了四个shRNA干扰靶点,并根据其基因序列设计并合成了四对含干扰序列的寡聚单链DNA,然后将其退火成双链,插入shRNA漫病毒载体中,构建四个shRNA慢病毒重组质粒,并转化至感受态细胞DH5 alpha,经测序鉴定均为阳性克隆。之后进行慢病毒包装,病毒原液的收集和超滤浓缩,以及病毒滴度的测定。最后,用包装好的四组shRNA慢病毒以及阴性对照的慢病毒分别感染大鼠BMSCs,通过Western Blotting评价干扰载体对靶基因的干扰效果,再向沉默表达HIF-lalpha的大鼠BMSCs再次转染HIF-lalpha质粒,造成目的基因的过表达,通过Western blotting验证靶基因的回复效应,表明本实验的结果不是由于脱靶效应产生的。选择沉默效果最好的shRNA4感染后的靶细胞构建稳定株,对稳定株细胞进行细胞增殖活性及成骨分化能力鉴定均成功。6.观察HIF-1 alpha在周期性张应力大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的作用：对正常细胞、沉默表达HIF-1 alpha的细胞、阴性对照感染的细胞分别进行最适力值的刺激,即加载1Hz频率、5%拉伸强度的周期性张应力6h,采用qPCR和Western blotting检测三组细胞加力后的ALP活性,及成骨样基因骨钙素(Osteocalcin,OCN)、骨桥蛋白(Osteopontin, OPN)、骨涎蛋白(Bone sialoprotein, BSP)、成骨相关转录因子2 (Runt related transcription factor 2, RUNX2)、Osterix基因的mRNA和蛋白表达变化。正常大鼠骨髓间充质干细胞表达ALP,沉默表达HIF-1 alpha后,ALP表达活性升高(P0.05),但对照组细胞ALP表达未发生明显变化(P0.05)。正常大鼠骨髓间充质干细胞有OCN、OPN、BSP、RUNX2、 Osterix的mRNA和蛋白表达,沉默表达HIF-1 alpha后,OCN、OPN、BSP、RUNX2、 Osterix的mRNA和蛋白表达均升高(P0.05),但对照组细胞OCN、OPN、BSP、 RUNX2、Osterix的mRNA和蛋白表达未发生明显变化(P0.05)。同时检测细胞HIF-1 alpha,及其下游基因VEGF和TWIST的mRNA和蛋白表达水平,发现正常大鼠骨髓问充质干细胞有VEGF、TWIST和HIF-1 alpha的mRNA和蛋白表达,沉默表达HIF-1 alpha后VEGF和TWIST的表达量也有所减少(P0.05),但对照组细胞未发生明显变化(P0.05)。推测成骨样因子的变化可能与HIF-1 alpha下游基因VEGF和TWIST有关,但具体机制仍需进一步验证。结论1. HIF-1 alpha在大鼠单侧上颌牙齿移动模型中的表达有明显变化,从而确定其参与了大鼠牙齿移动过程中牙周组织的改建,在正畸牙齿移动的机制中具有重要意义。2.周期性张应力刺激可诱导大鼠骨髓间充质干细胞体外成骨向分化,最适加力条件为1Hz频率、5%拉伸强度,并加载6h。在该过程中HIF-1 alpha在mRNA及蛋白水平的表达均增强,且随加力时间延长表达增强,表明HIF-1 alpha可对力学刺激作出阳性反应,从细胞水平证实HIF-1 alpha参与了力环境下成骨分化的过程。3.沉默表达HIF-1 alpha可促进周期性张应力加载下的大鼠骨髓间充质干细胞的成骨向分化。创新和意义本课题从细胞水平证实HIF-1 alpha参与了张力侧牙齿移动过程中牙周组织的改建；提出了以HIF-1 alpha作为周期性张应力介导的大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的生物学靶点：并采用了干扰目的基因片段的技术方法,从分子生物学水平证实,沉默HIF-1 alpha的表达可促进周期性张应力介导的成骨分化作用。
【关键词】：低氧诱导因子1 alpha(Hypoxia-inducible factor-1alpha) 成骨分化 周期性张应力 骨髓间充质干细胞(Bone mesenchyumal stem cells BMSCs)
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R783.5
【目录】：

• 中文摘要8-13
• Abstract13-20
• 英文缩略语说明20-22
• 第一部分 大鼠正畸牙齿移动过程中HIF-1 alpha的表达和意义22-46
• 前言22-23
• 材料与方法23-31
• 结果31-33
• 讨论33-36
• 小结36-37
• 附图表37-43
• 参考文献43-46
• 第二部分 周期性张应力介导的大鼠BMSCs成骨分化过程中HIF-1alpha的表达变化46-91
• 前言46-47
• 材料与方法47-67
• 结果67-71
• 讨论71-78
• 小结78-79
• 附图表79-87
• 参考文献87-91
• 第三部分 周期性张应力下HIF-1 alpha对大鼠BMSCs成骨分化的作用机制初探91-137
• 前言91-92
• 材料与方法92-114
• 结果114-120
• 讨论120-124
• 小结124-125
• 附图表125-133
• 参考文献133-137
• 全文总结137-138
• 致谢138-140
• 攻读学位期间发表的学术论文目录140-141
• 英文论文一141-149
• 英文论文二149-159
• 学位论文评阅及答辩倩况表159

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 陈彬;李琥;穆超;侯伟;陈文静;;大鼠正畸牙移动中HIF-1_α的表达[J];口腔生物医学;2011年02期

2 黄艳;王旭霞;张君;张文娟;;正畸牙移动实验动物模型的建立[J];口腔医学;2007年02期

  本文关键词：HIF-1alpha对周期性张应力诱导的大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：270835