Vasohibin1对结肠癌血管生成调控和肿瘤细胞抑制功能的临床和分子机制研究

发布时间：2017-03-27 19:16

  本文关键词：Vasohibin1对结肠癌血管生成调控和肿瘤细胞抑制功能的临床和分子机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景和目的：结肠癌是常见的恶性肿瘤,在美国每年大约有100,000新增病例、50,000死亡病例,在我国结直肠癌发病率约占所有恶性肿瘤的10%-15%。结肠癌的治疗手段包括手术、放疗、化疗、分子靶向治疗等,结肠癌经过根治性切除术和辅助化疗,在5年内仍有较高的复发率。研究表明,肿瘤的血管生成在肿瘤的发生发展、复发转移中起着关键作用。肿瘤血管生成是一种动态过程,是血管生成促进因子和血管生成抑制因子相互作用的结果。Vasohibinl是近年发现的一种新的血管抑制因子。Vasohibin (VASH)家族包括VAS H1和VASH2。VASH1由VEGF-A口FGF-2刺激产生,并选择性的表达于血管内皮细胞。VASH1有两个亚型、VASH1-A和VASH1-B。VASH1的同源异构体VASH2主要表达于单核细胞。VASH1多表达在血管内皮生成的终末区,抑制新生血管形成。VASH2多表达在血管内皮生成的起始端,促进血管形成。VASH1作为血管生成抑制剂在肿瘤血管生成过程中发挥重要的作用。研究发现VASH1在乳腺癌、尿路上皮癌、肝癌、肺癌等癌组织的血管内皮中高表达,并且与肿瘤的发生、发展及复发、转移密切相关,但在结肠癌中尚未有相关研究。此外VASH1不仅表达于血管内皮,近年研究发现VASH1还表达于肿瘤细胞。但其具体的生物学功能,尤其在调节肿瘤细胞发生发展方面的功能,尚不清楚。基于以上研究背景,本课题主要通过分析VASH1在结肠癌组织中的表达情况,回顾性分析肿瘤血管内皮细胞中VASH1的表达和肿瘤细胞中VASH1的表达与临床病理资料的相关性；使用VASH1-A和VASH1-B的过表达质粒,转染结肠癌细胞系HT29,使用shRNA干扰、沉默结肠癌细胞系HCT116中VASH1基因的转录表达。通过以上途径,研究VASH1对结肠癌细胞生长、粘附、迁移等生物学行为的影响及其机制,探讨VASH1通过激活、参与细胞的凋亡、衰老,发挥其对肿瘤细胞的抑制作用；使用皮下移植瘤模型和肿瘤转移模型,进一步验证VASH1对结肠癌肿瘤细胞生长和转移的影响及其机制,为结肠癌靶向治疗,开辟新的方向和途径。方法：1. VASH1在结肠癌组织中的表达及临床意义：选取山东省济南市中心医院病理科存档且临床病理资料完整的75例结肠癌癌组织及相应癌旁组织,应用免疫组织化学方法检测在结肠癌组织中,VASH1在血管内皮的表达、VEGF-A、 VEGF-C的表达,以及肿瘤微血管密度(MVD, CD34标记)、肿瘤微淋巴管密度(]LVD, D2-40标记),分析血管内皮表达VASH1与VEGF-A、CD34、VEGF-C.D2-40表达的相关性,及其与结肠癌相关临床病理特征的相关性。2.应用免疫组织化学方法,检测VASH1在结肠癌组织中肿瘤细胞的表达,分析结肠癌组织中,肿瘤细胞表达VASH1与结肠癌相关临床病理特征的相关性。3.使用Real Time PCR 和 Weastern Blot方法,检测VASH1在不同结肠癌细胞系中的表达,筛选VASH1的高表达细胞系和低表达细胞系。4.选用VASH1低表达细胞系HT29,转染、过表达VASHl-A和VASH1-B,通过绘制生长曲线、3H-TdR掺入实验、平板克隆实验,检测VASH1对结肠癌细胞生长、增值的影响；通过SA-β-gal染色和流式细胞术,检测VASH1对结肠癌细胞衰老和凋亡的影响。5. VASH1过表达人脐静脉血管内皮细胞,通过小管形成实验,检测其对血管形成的影响。6. VASH1敲除对结肠癌细胞生物学行为的影响：shRNA转染VASH1高表达细胞系HCT116,敲除、沉默VASH1的表达。通过生长曲线、3H-TdR掺入实验、平板克隆实验,研究VASH1对结肠癌细胞生长、增值的影响。应用粘附实验检测VAS H1对肿瘤细胞粘附能力的影响。通过Transwell迁移实验和划痕实验检测VASH1对肿瘤细胞迁移能力的影响。7. VASH1过表达移植瘤模型建立：裸鼠皮下注射过表达VASH1-A, VASH1-B及空载体的结肠癌HT29细胞(5×106)。注射后每隔3天用游标卡尺测量肿瘤大小,绘制移植瘤生长曲线。肿瘤超过2cm处死小鼠,取出肿瘤组织并称重。移植瘤组织免疫组化检测KI-67、Cleaved Caspase-3及CD34,研究VASH1在体内对结肠癌细胞生长、增值、凋亡及血管生成的影响；移植瘤组织SA-β-gal染色,检测VASH1在体内对组织衰老机制的影响。8. VASH1沉默移植瘤模型建立：Rag1-/-小鼠皮下注射转染shRNA及Control shRNA的HCT116 (4×106)。其余方法同步骤6。9.转移瘤模型建立：尾静脉注射法将转染shRNA及Control shRNA的HCT116(2×106)注射到Ragl-/-小鼠体内。注射6周后处死小鼠,取肺、肝组织,解剖显微镜下计数转移灶。使用OCT包埋组织速冻后,切片HE染色验证转移灶。结果：1. VASH1蛋白在结肠癌组织间质的血管内皮细胞中表达,而不表达于间质的淋巴管内皮细胞。过表达VASH1-A或VASH1-B的人脐静脉内皮细胞,可形成不完整的管状结构,且其分支点数低于空白载体组,差异有显著性(p≤0.01)。VASH1在结肠癌组织间质的表达明显高于癌旁组织(p0.01),两者呈正相关(p=0.004)。VEGF-A、CD34、VEGF-C、D2-40在结肠癌肿瘤组织中的表达,均高于癌旁组织(p0.01)。结肠癌肿瘤间质VASH1的表达与MVD表达呈正相关,与VEGF-A、VEGF-C、LVD无相关性。结肠癌肿瘤间质VASH1的表达与肿瘤体积(p=0.021124)、肿瘤临床分期(p=0.0069078)、远处转移(p=0.0031225)呈负相关。2. VASH1在结肠癌细胞中的表达及临床意义：免疫组化检测结果显示在结肠癌组织切片中,VASHl也肿瘤细胞中表达,并与远处转移呈正相关(p=0.01613).3. VASH1在肿瘤细胞系的表达：Real Time PCR检测VASH1-A, VASH1-B在肿瘤细胞系中的表达。VASH1-A在所检测的肿瘤细胞系中均有表达,其中乳腺癌MCF7表达最高。结肠癌细胞系中HT29表达最低,HCT116表达最高。VASH1-B在所检测的肿瘤细胞系中均有表达,其中乳腺癌MCF7表达最高。结肠癌细胞系中HT29表达最低,HCT116表达最高。4.过表达VASH1对结肠癌细胞生物学行为的影响：通过生长曲线、3H-TdR掺入实验、平板克隆实验,检测过表达VASH1-A, B基因后对HT29细胞生长、增殖的影响。与对照组相比,VASH1过表达组细胞的生长、增殖及克隆形成能力明显减弱,差异有统计学意义(p0.05),提示过表达ASH1-A、B基因抑制HT29细胞增殖,使其生长速度减缓,克隆形成能力降低；流式细胞仪检测结果提示过表达VASH1-B促进肿瘤细胞凋亡(p0.01)。SA-β-gal染色结果提示过表达VASH1-A促进肿瘤细胞衰老(p0.01)5.敲除VASH1对结肠癌细胞生物学行为的影响：通过生长曲线、3H-TdR掺入实验、平板克隆实验,检测沉默VASH1基因后HCT116细胞的增殖情况。与对照组相比,shRNA干扰组细胞的增殖速度显著提高,差异有统计学意义(P0.01)。粘附实验结果,shRNA干扰、沉默VASH1显著提高HCT116细胞的粘附能力。Transwell迁移实验和划痕实验结果显示,shRNA干扰、沉默VASH1显著增强HCT116细胞的迁移能力(p0.05)。6.通过HT29细胞裸鼠皮下移植模型,观察VASH1在体内对结肠癌细胞增值的影响：肿瘤体积曲线显示,VASH1-A、VASH1-B过表达组肿瘤生长速度显著低于空载体对照组(p=0.025)。检测肿瘤重量提示,空载体对照组肿瘤重量明显高于VASH1-A、VASH1-B过表达组(p0.01)。免疫组合检测显示,VASH1-A、 VASH1-B过表达组,肿瘤组织KI-67的表达小于空载体对照组(p0.05)；VASH1-B过表达组,肿瘤组织Cleaved Caspase-3的表达显著高于空载体对照组(p0.01)；肿瘤组织表达的CD34在三组间无明显差异。SA-β-gal染色结果显示,VASH1-A过表达组,阳性细胞高于空载体对照组(p0.05)。7.通过HCT116细胞Rag1-/-小鼠皮下移植模型,观察VASH1在体内对结肠癌细胞增值的影响：肿瘤体积曲线显示,shRNA沉默组肿瘤生长速度显著快于control shRNA组(p0.01)。肿瘤重量结果显示,shRNA沉默组肿瘤重量大于. control shRNA组(p0.05)。免疫组化结果提示,shRNA沉默组KI-67表达高于control shRNA组。8.通过HCT116细胞Rag1-/--/-鼠转移瘤模型,观察VASH1对结肠癌转移的影响：成模后6周取肺、肝组织,计数表面肿瘤表面转移灶。切片HE染色进行病理形态学观察。结果提示,shRNA沉默组肺组织的肿瘤转移灶(p0.05)及肝组织的肿瘤转移灶(p0.01)明显高于control shRNA组,差别有统计学意义。结论：1. VASH1表达于结肠癌间质的血管内皮细胞,抑制血管生成并与肿瘤体积、临床分期、远处转移呈负相关。2. VASH1表达于结肠癌组织的肿瘤细胞,与肿瘤的远处转移成正相关。提示肿瘤细胞表达的VASH1,与血管内皮细胞中表达的VAS HI功能不同。3.诱导VASH1在结肠癌细胞中过表达、沉默,证实VASH1可以抑制结肠癌细胞的生长、增值、粘附及迁移。4. VASH1-A参与诱导结肠癌细胞衰老；VASH1-B可以促进结肠癌细胞凋亡。VASH1-A和VASH1-B通过不同的机制发挥对结肠癌细胞的抑制作用。5.皮下移植瘤模型证实,VASH1在体内环境下,通过激活、刺激结肠癌细胞衰老、凋亡机制,抑制肿瘤细胞生长、增殖。6.转移瘤模型证实,VAS H1沉默后,显著促进结肠癌细胞的体内迁移、转移,阻断了VASH1对肿瘤的抑制作用。
【关键词】：结肠癌 Vasohibin-1 细胞衰老 细胞凋亡 血管生成
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.35
【目录】：

• 中文摘要6-11
• ABSTRACT11-17
• 符号说明17-19
• 第一部分 结肠癌间质Vasohibin-1的表达及临床意义19-52
• 前言19-21
• 材料与方法21-28
• 结果28-32
• 讨论32-37
• 结论37-38
• 附图表38-48
• 参考文献48-52
• 第二部分 Vasohibin-1在结肠癌细胞中的表达及对结肠癌细胞抑制功能的机制研究52-120
• 前言52-53
• 材料与方法53-78
• 结果78-85
• 讨论85-92
• 结论92-93
• 附图表93-115
• 参考文献115-120
• 致谢120-121
• 发表论文及获奖情况121-122
• 学位论文评阅及答辩情况表122-123
• 英文文章Ⅰ123-139
• 英文文章Ⅱ139-166

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本文编号：270928