SUPT5H,人结肠癌细胞中一个新的肿瘤特异性端粒酶逆转录酶启动子结合蛋白
发布时间：2020-07-21 14:06
【摘要】：人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)是端粒酶的核心催化亚单位,在端粒酶活性发挥中起关键作用。正常体细胞中检测不到端粒酶活性或其活性很低,而在生殖细胞和胚胎干细胞中端粒酶活性常呈增高。至少80%的人类肿瘤可以观察到由端粒酶调控异常导致的酶活性异常增高。hTERT表达升高被认为是细胞永生化和肿瘤发生、进展的标志性指标。肿瘤细胞能够特异性地利用多种转录因子与hTERT启动子的结合促进hTERT基因在肿瘤细胞中的高表达。研究表明,端粒酶在结肠癌演变中具有重要的作用。因此,发现并鉴定结肠癌细胞中能够特异性地与hTERT启动子结合的调控蛋白,研究其功能,对于了解结肠癌发生、发展机制具有重要意义。目的在人结肠癌细胞中我们发现了一个新的肿瘤特异性hTERT启动子结合蛋白SUPT5H,通过相关实验研究该蛋白的功能并阐明其与结肠癌发生和发展的可能机制。方法以人结肠癌细胞株为模板,运用链霉亲和素-琼脂糖珠垂钓法及染色质免疫共沉淀垂钓、鉴定和验证SUPT5H为新的hTERT启动子结合蛋白；应用免疫印迹技术检测人正常结肠上皮细胞株和结肠癌细胞株核中SUPT5H蛋白的表达；利用RT-qPCR和免疫组化技术检测人结直肠癌组织和正常结直肠组织中SUPT5HmRNA和蛋白的表达；应用hTERT启动子报告基因研究SUPT5H蛋白对hTERT启动子活性的影响；应用基因转导和shRNA干扰技术特异性地抑制结肠癌细胞株SUPT5H蛋白的表达,研究SUPT5H蛋白对结肠癌细胞增殖、衰老和凋亡等生物学功能的影响。结果与人正常结肠上皮细胞株细胞核内SUPT5H蛋白表达水平相比较,结肠癌细胞株核内该蛋白呈现明显的高表达。人结直肠癌组织中,观察到SUPT5H在mRNA和蛋白水平显著的高表达。SUPT5H蛋白表达水平与结直肠癌远处转移正相关。利用SUPT5H基因特异性短发夹RNA抑制内源性SUPT5H的表达能够减弱hTERT启动子驱动的绿色荧光蛋白的表达,但对CMV启动子驱动的绿色荧光蛋白的表达未显现出减弱的作用。干扰SUPT5H的表达不仅能够有效地抑制结肠癌细胞端粒酶的活性、细胞的生长和迁移,还能促进细胞衰老。结论SUPT5H是人结肠癌细胞中一个新的肿瘤特异性端粒酶逆转录酶启动子结合蛋白。SUPT5H过表达激活了hTERT基因的转录。在人结直肠癌组织中,观察到SUPT5H显著的高表达。抑制结肠癌细胞SUPT5H的表达,展现出一定的抗肿瘤作用。SUPT5H可能作为结直肠癌一个新的肿瘤标志物和／或治疗靶点。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.35
【图文】：
为了验证在体内实验中ＳＵＰＴ５Ｈ与ｈＴＥＲＴ启动子的肿瘤特异性结合能否在生逡逑理状态下被重复，我们采用ＣＵＰ分析法，ＷＳＵＰＴ５Ｈ特异性抗体分析在活细胞中逡逑ＳＵＰＴ５Ｈ与染色体ｈＴＥＲＴ的结合情况（图４．３）。Ｃｈｉｐ分析法证实ＳＵＰＴ５Ｈ与染色逡逑体ｈＴＥＲＴ的结合是肿瘤特异性的。逡逑厂厂Ｄ８４１逡逑ＣＯＮ邋ＳＷ６２０邋ＨＴ２９邋Ｃ0１0３２０邋ＲＫＯ邋ＨＣＥ８６９３逡逑．ＩＨＩＫｒ？，‘＊逦蹲早．‘－‘Ｍｌ逡逑图４．３邋Ｃｈｉｐ分析法分析在活细胞中ＳＵＰＴ５Ｈ与染色体ｈＴＥＲＴ结合的情况。图中在逡逑结肠癌细胞株巧Ｗ６２０，邋ＨＴ－巧，Ｃ0１0３２０，邋ＲＫＯ，邋ＨＣＥ８６９３）所对应巧沫道中观察到逡逑明显的ＤＮＡ条带，而在正常结肠上皮细胞株ＣＣＤ８４１邋ＣｏＮ中未显现。ＮｏｒｍａｌＩｇＧ逡逑为阴性对照。逡逑２９逡逑
图４．４邋（ａ）邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ方法检测正常结肠上皮细胞株ＣＣＤ８４１ＣＯＮ核内与结肠癌逡逑细胞株ＲＫＯ、ＨＴ２９核内ＳＵＰＴ５Ｈ的表达情况。可见与正常肠上皮细胞相比，结逡逑肠癌细胞株ＲＫＯ、ＨＴ２９核中ＳＵＰＴ５Ｈ的表达显著提高。（ｂ）利用ＲＴ－ｑＰＣ艮技术逡逑检测并分析比较了邋１５０例原发结直肠癌患者肿瘤}D织与其正常结直肠组织中逡逑ＳＵＰＴ}D和ｈＴＥＲＴ邋ｍＲＮＡ的表达，结果表明结直肠癌组织中ＳＵＦＴ沉和ｈＴＥ民Ｔ逡逑ｌｎＲＮＡ的表达水平显著提高（＾＊＾ｐ＜化０５）。（Ｃ）邋１０例正常结直肠枯膜组织和１００例逡逑原发结直厥癌患者肿瘤组织中ＳＵＰＴ５Ｈ蛋白表这的免疫组织化学技术检测。肺瘤逡逑组织中ＳＵＰＴ５Ｈ蛋白的表达显著高于正常结直肠枝膜组织（ｐ＜＾０５）。放大倍数逡逑ｘ２００邋和邋ｘ４００。逡逑４．５邋１５０例结直肠癌患者肿瘤组织中ＳＵＰＴ５Ｈ和ｈＴＥＲＴｍＲＮＡ表巧水逡逑平的相关挫分析逡逑
浙江大学博±学位论文逦正文一结巧逡逑４．７邋ＳＵＰＴ５Ｈ表达巧制结肠癌灥胞株的筛选逡逑使用ＲＮＡ干扰技术，采用ＳＵＰＴ５Ｈ基因特异化ｓｈＲＮＡ表达载体（ＴＧ３０９００５，逡逑ＯｒｉＧｅｎｅ）稳定转染结肠癌细胞化ＲＫＯ和ＨＴ２９，利用Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ技术检测筛选逡逑ＳＵＰＴ５Ｈ表达抑制效果较好的细胞株，命名为ＲＫ０（ｓｈＳＵＰＴ５Ｈ－ｌ，化ＳＵＰＴ５Ｈ－２，逡逑ｓｈＳＵＰＴ５Ｈ－３）和邋ＨＴ２９（油ＳＵＰＴ５Ｈ－１，邋ｓｈＳＵＰＴ５Ｈ－２，ｓｈＳＵＰＴ５Ｈ－３）。并设立阴性对逡逑照（ＴＲ３０００７，邋ＯｒｉＧｅｎｅ），命名为邋ＲＫＯ（ｓｈＮＳＣ）和邋ＨＴ２９（ｓｈＮＳＣ）。逡逑
本文编号：2764518
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.35
【图文】：
为了验证在体内实验中ＳＵＰＴ５Ｈ与ｈＴＥＲＴ启动子的肿瘤特异性结合能否在生逡逑理状态下被重复，我们采用ＣＵＰ分析法，ＷＳＵＰＴ５Ｈ特异性抗体分析在活细胞中逡逑ＳＵＰＴ５Ｈ与染色体ｈＴＥＲＴ的结合情况（图４．３）。Ｃｈｉｐ分析法证实ＳＵＰＴ５Ｈ与染色逡逑体ｈＴＥＲＴ的结合是肿瘤特异性的。逡逑厂厂Ｄ８４１逡逑ＣＯＮ邋ＳＷ６２０邋ＨＴ２９邋Ｃ0１0３２０邋ＲＫＯ邋ＨＣＥ８６９３逡逑．ＩＨＩＫｒ？，‘＊逦蹲早．‘－‘Ｍｌ逡逑图４．３邋Ｃｈｉｐ分析法分析在活细胞中ＳＵＰＴ５Ｈ与染色体ｈＴＥＲＴ结合的情况。图中在逡逑结肠癌细胞株巧Ｗ６２０，邋ＨＴ－巧，Ｃ0１0３２０，邋ＲＫＯ，邋ＨＣＥ８６９３）所对应巧沫道中观察到逡逑明显的ＤＮＡ条带，而在正常结肠上皮细胞株ＣＣＤ８４１邋ＣｏＮ中未显现。ＮｏｒｍａｌＩｇＧ逡逑为阴性对照。逡逑２９逡逑
图４．４邋（ａ）邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ方法检测正常结肠上皮细胞株ＣＣＤ８４１ＣＯＮ核内与结肠癌逡逑细胞株ＲＫＯ、ＨＴ２９核内ＳＵＰＴ５Ｈ的表达情况。可见与正常肠上皮细胞相比，结逡逑肠癌细胞株ＲＫＯ、ＨＴ２９核中ＳＵＰＴ５Ｈ的表达显著提高。（ｂ）利用ＲＴ－ｑＰＣ艮技术逡逑检测并分析比较了邋１５０例原发结直肠癌患者肿瘤}D织与其正常结直肠组织中逡逑ＳＵＰＴ}D和ｈＴＥＲＴ邋ｍＲＮＡ的表达，结果表明结直肠癌组织中ＳＵＦＴ沉和ｈＴＥ民Ｔ逡逑ｌｎＲＮＡ的表达水平显著提高（＾＊＾ｐ＜化０５）。（Ｃ）邋１０例正常结直肠枯膜组织和１００例逡逑原发结直厥癌患者肿瘤组织中ＳＵＰＴ５Ｈ蛋白表这的免疫组织化学技术检测。肺瘤逡逑组织中ＳＵＰＴ５Ｈ蛋白的表达显著高于正常结直肠枝膜组织（ｐ＜＾０５）。放大倍数逡逑ｘ２００邋和邋ｘ４００。逡逑４．５邋１５０例结直肠癌患者肿瘤组织中ＳＵＰＴ５Ｈ和ｈＴＥＲＴｍＲＮＡ表巧水逡逑平的相关挫分析逡逑
浙江大学博±学位论文逦正文一结巧逡逑４．７邋ＳＵＰＴ５Ｈ表达巧制结肠癌灥胞株的筛选逡逑使用ＲＮＡ干扰技术，采用ＳＵＰＴ５Ｈ基因特异化ｓｈＲＮＡ表达载体（ＴＧ３０９００５，逡逑ＯｒｉＧｅｎｅ）稳定转染结肠癌细胞化ＲＫＯ和ＨＴ２９，利用Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ技术检测筛选逡逑ＳＵＰＴ５Ｈ表达抑制效果较好的细胞株，命名为ＲＫ０（ｓｈＳＵＰＴ５Ｈ－ｌ，化ＳＵＰＴ５Ｈ－２，逡逑ｓｈＳＵＰＴ５Ｈ－３）和邋ＨＴ２９（油ＳＵＰＴ５Ｈ－１，邋ｓｈＳＵＰＴ５Ｈ－２，ｓｈＳＵＰＴ５Ｈ－３）。并设立阴性对逡逑照（ＴＲ３０００７，邋ＯｒｉＧｅｎｅ），命名为邋ＲＫＯ（ｓｈＮＳＣ）和邋ＨＴ２９（ｓｈＮＳＣ）。逡逑
本文编号：2764518
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