α-突触核蛋白自噬性降解障碍在环境毒素鱼藤酮导致帕金森症中机制研究

发布时间：2020-08-01 12:34

【摘要】：目的:环境毒素鱼藤酮能够引发α-突触核蛋白(α-synuclein)在中脑黑质区多巴胺神经元中蓄积、导致多巴胺神经元发生退行性病变,其分子机制尚不完全明确;我们证明鱼藤酮能够通过损伤溶酶体,引起自噬流阻滞,蛋白降解障碍,α-synuclein在中脑黑质区多巴胺神经元内堆积后导致帕金森症发病。方法:我们在长期鱼藤酮皮下注射Lewis大鼠制备的帕金森大鼠模型和多巴胺能细胞系PC12细胞鱼藤酮体外干预模型基础上,观察鱼藤酮引起的α-synuclein自噬降解障碍并探讨其作用机制。在体内模型中,我们分别通过免疫组织化学法观察大鼠中脑黑质区多巴胺神经元数量,免疫印迹法检测纹状体和腹侧中脑区酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)含量,动物自发活动仪进行行为学研究,明确帕金森症动物造模成功。然后通过形态学检测大鼠中脑黑质区多巴胺神经元内α-synuclein聚集体,电镜观察自噬体数量,腹侧中脑取材后PCR法检测α-synuclein的m RNA水平,免疫印迹法检测α-synuclein以及自噬标记物microtubule-associated protein 1 light chain 3-II(LC3-II),Beclin 1,和p62等蛋白水平。免疫荧光法双标TH/α-synuclein,TH/LAMP2,TH/cathepsin D。在体外模型中,我们使用CCK8法检测PC12细胞活力确定鱼藤酮损伤浓度,同上检测鱼藤酮干预后α-synuclein、LC3-II、Beclin 1、p62等蛋白水平。使用自噬阻滞剂Bafilomycin A1判断鱼藤酮干预后自噬流通畅与否。免疫荧光法双标LAMP2/cathepsin D,提纯溶酶体后进行孵育,收取上清液后用免疫印迹法检测溶酶体酶cathepsin D的漏出情况。同时使用N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-beta-D-glucosaminidase,NAG)检测试剂盒进一步明确溶酶体膜通透性改变情况。验证自噬激动剂海藻糖对环境毒素鱼藤酮导致的神经细胞毒性的保护作用,并且检测海藻糖使用后鱼藤酮体内外帕金森症模型转录因子EB(TFEB)、LC3-II和LAMP2蛋白表达量,免疫荧光法检测外源性GFP-LC3脂质体转染后点状聚集体变化情况和Lyso Tracker观察溶酶体荧光强度,分别使用使用质核分离试剂盒和免疫荧光法观察自噬激动剂海藻糖使用后TFEB蛋白入核现象。结果:环境毒素鱼藤酮干预后能够导致Lewis大鼠中脑黑质区TH阳性细胞丢失,伴随自发活动明显降低。发生神经退行性病变的多巴胺神经元内有大量α-synuclein蓄积,同时自噬体数量显著增多,溶酶体内水解酶cathepsin D从溶酶体内漏出到胞浆中。在体外模型中,鱼藤酮能够明显上调α-synuclein、LC3-II、Beclin 1、p62等蛋白水平,提示自噬流阻滞。鱼藤酮导致PC12细胞溶酶体膜通透性增高,使其中水解酶大量释放到胞浆中,这种损伤作用作用可以被活性氧(reactive oxygen species,ROS)清除剂4,5-dihydroxyl-1,3-benzededisulfonic acid(tiron)所缓解。自噬激动剂海藻糖能够引发TFEB发生核转位,恢复溶酶体功能,加速自噬体的清除,降解α-synuclein;海藻糖对鱼藤酮体内外模型具有保护作用。结论:我们发现溶酶体损伤是环境毒素鱼藤酮导致帕金森症的机制之一,保护溶酶体功能将成为抗帕金森症药物研发的重要靶点。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R742.5

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