间充质干细胞及胰岛素分泌细胞治疗糖尿病的临床及应用基础研究

发布时间：2020-08-29 11:01

　　研究背景：糖尿病(Diabetes mellitus, DM)发病率高,其并发症严重威胁着人类健康。目前主要治疗方法是口服降糖药物和／或应用胰岛素等,但患者需要长期甚至终生服药,药物副作用大,且不能从根源上解决问题。近年也有成功应用造血干细胞移植、胰岛移植治疗1型糖尿病的报道,有一定疗效,但费用高、风险大,此外移植患者需长期服用免疫抑制剂。由此可见,研发一种安全、长效的治疗糖尿病及其并发症的方法是迫切需要的。研究表明,1型糖尿病(Type 1 diabetes mellitus, T1DM)和2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus, T2DM)均与免疫损伤和炎性反应有密切的关系。因此,有效抑制或阻断免疫损伤过程应具有保护β细胞免受损伤、维持胰岛功能和纠正胰岛素抵抗的功效。间充质干细胞(Mesenchymal stem cell, MSC)具有强大的免疫抑制作用,特定条件下能够分化为p样细胞,分泌胰岛素。另外,MSC具有组织修复、促进血管形成、抗氧化、纠正糖尿病代谢紊乱和胰岛素抵抗等功能。由此可见,MSC可在糖尿病发生的多个环节发挥作用。MSC来源广泛,目前骨髓和脂肪组织来源的MSC研究较多,但存在高度病毒污染的可能、随着年龄增长扩增、分化能力下降以及有可能促进肿瘤生长等缺点,而脐带来源的间充质干细胞(Umbilical cord derived mesenchymal stem cell, UMSC)与骨髓、脂肪来源的MSC一样具有多向分化、支持造血和调节免疫等功能,但因其具有来源广泛、取材方便、不受任何伦理学限制、分化潜能大、增殖能力强、免疫原性低、病毒感染机会小、对供者无不良影响、克服了骨髓、脂肪源性MSC的缺点,成为可能替代骨髓、脂肪源性MSC的细胞治疗重要来源。本研究建立了UMSC培养体系,并在NCBI Clinical Trial上登记UMSC治疗糖尿病的临床试验(NCT01413035),在此框架基础上深入研究UMSC治疗2型糖尿病及糖尿病并发症的临床作用及其相关机制。该研究成果将对合理应用MSC治疗糖尿病有重要的指导意义。胰岛移植被认为是有望治愈DM的方法之一,但由于胰岛供体来源的限制、胰岛细胞在体外存活率低以及移植后免疫排斥等问题大大限制了其临床应用。因此,寻求其他来源的胰岛素分泌细胞(Insulin producing cell,IPC)用于替代胰岛移植治疗DM成为目前的研究热点,此方面研究的突破将有望为治愈DM提供理论依据和治疗手段。干细胞研究进展为探索以干细胞为种子体外诱导分化生成IPC提供了可能。胚胎干细胞(Embryonic stem cell, ESC)是一种全能性的干细胞,可以分化为IPC,体内外发挥降糖作用,但存在伦理和致瘤性问题；诱导性多能干细胞(Induced pluripotent stem cell, IPS)也能在一定条件下分化为IPC,但IPS诱导过程中需病毒转染,病毒载体容易和转染细胞DNA整合,同样存在致瘤风险；胰腺干细胞在特定条件下分化为IPC,但胰腺干细胞来源及表型尚不明确,且其培养非常困难。因此,寻找安全、有效的IPC来源的干细胞成为解决问题的关键。UMSC不但能分化为IPC,降低糖尿病动物的血糖,而且具有免疫抑制作用,抑制免疫系统对胰岛β细胞的损伤和减轻胰岛素抵抗,从而成为IPC的理想来源细胞,但在目前的技术手段下,UMSC来源的IPC诱导时间长、分化程度低、体外分泌的胰岛素数量也不能满足将来大规模临床应用的需要。由此,如何缩短UMSC向IPC诱导分化时间、提高分化效率以及IPC胰岛素分泌功能是解决临床应用的关键因素之一层粘连蛋白(Laminin)属于细胞外基质蛋白的一种,具有多种生物学功能。研究发现,在人类的胰岛,存在着双层结构不同的基底膜,并检测到lam in in的存在。Laminin可以促进胰岛β细胞胰岛素基因的表达和胰岛素的分泌,其中涉及的主要laminin亚型是laminin 111、laminin 411和laminin 511,这三种laminin都在胰岛周围毛细血管内皮细胞上表达。因此,推测laminin I11、laminin 411和laminin 511可能具有调控MSC向IPC分化功能。基于如上研究,我们首先优化了UMSC向IPC分化体系,然后在分化过程中加入Iaminin411,观察其对UMSC来源的IPC(UMSC-IPC)分化效率、胰岛素分泌功能的影响并探讨其作用机制,为进一步提高UMSC向IPC分化效率及IPC胰岛素分泌提供理论依据。本研究分三部分进行阐述：第一部分为UMSC输注对2型糖尿病及其并发症的临床治疗作用和相关机制研究；第二部分探讨laminin 411对UMSC向IPC诱导分化作用及其机制探讨；第三部分为下一步工作计划。具体如下：第一部分脐带间充质干细胞治疗2型糖尿病临床研究目的：研究UMSC治疗2型糖尿病及其并发症的安全性、临床疗效及其相关机制,以期寻找一种安全、长效的治疗2型糖尿病及其并发症的方法。材料与方法：在获得山东大学第二医院伦理委员会审批同意后,无菌留取健康剖宫产产妇的脐带组织,按照UMSC制备标准操作流程分离、培养、扩增脐带间充质干细胞,通过细胞形态学、免疫表型和多向分化潜能对所获细胞进行鉴定。按照入组和剔除标准选取2009.07-2012.10我院收治的18例T2DM患者静脉输注UMSC,每次间隔2周,共2-3次,按照疗效评价标准,比较治疗前、治疗后第1、3、6月患者的各项指标变化,并详细记录所有不良反应。综合数据使用SPSS 19.0软件分析。结果：成功获得符合GMP标准的UMSC,该细胞具有以下特点：呈长梭形纤维样细胞,贴壁生长,可以稳定传代；高表达CD73、CD90、CD105、CD166,低或不表达HLA-DR、CD34、CD45;具有多向分化的潜能,可以在适宜的条件下,分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。根据疗效评价标准,UMSC治疗分为有效组和无效组,两者在临床基线特征方面无统计学意义(p0.05)；治疗有效组患者FBG、PBG均显著降低(p0.05),血浆C肽水平和调节性T细胞(Treg)在有效组有升高趋势,但这两个参数的差异未达到统计学意义(p0.05)。在治疗过程中,18例患者中只有4例(22.2%)有轻微的发热反应,无其他不良反应。UMSC治疗后随访6个月,所有患者自觉身体一般情况较前改善,幸福指数较前提高。结论：UMSC治疗2型糖尿病安全可靠,未见严重不良反应。对部分患者,MSC能有效降低空腹和餐后血糖,其作用机制可能与调节Treg生成,抑制异常免疫系统对胰岛β细胞的损伤及改善外周组织对胰岛素的敏感性有关。该研究为进一步应用UMSC有效治疗2型糖尿病奠定了实践基础。第二部分脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞的分化和调控目的：观察laminin 411对UMSC向IPC分化效率以及IPC胰岛素分泌功能的影响,并探讨其作用机制,为UMSC来源的IPC有效治疗糖尿病奠定基础。材料与方法：UMSC分离、培养、扩增及鉴定同第一部分。经过4个阶段将UMSC诱导分化为IPC,通过流式细胞术、RT-PCR、Western blot、免疫荧光、DTZ染色及ELISA等检测方法在细胞表面分子表达、mRNA、蛋白水平、是否为胰岛β细胞及胰岛素分泌等方面对所诱导的细胞进行鉴定。在诱导过程中加入laminin 411,首先通过上述实验方法体外观察laminin 411对UMSC来源的IPC分化和成熟的影响,并研究其作用机制；其次,腹腔注射60mg/kg链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)破坏胰岛β细胞建立Wistar大鼠1型糖尿病动物模型,鼠尾静脉分别输注UMSC、UMSC诱导的IPC (UMSC-IPC)和添加laminin 411诱导分化的IPC(laminin 411-IPC),通过临床表现、血糖、C肽、体重、生存分析等指标,观察UMSC、UMSC-IPC和laminin 411-IPC对糖尿病大鼠的治疗作用。结果：在成功获得符合GMP标准的UMSC的前提下,在胰岛素转铁蛋白(ITS)、尼克酰胺等因子的作用下,经过4个阶段历时2周,成功将UMSC诱导分化为IPC,该细胞具有胰岛p细胞形态,高表达胰岛p细胞的标志物(Pdxl、Insulin),在高糖刺激下胰岛素分泌量达到(189.8±93.05)μIU/ml。在诱导分化过程中,加入laminin 411,IPC的生成量虽无明显增加,但胰岛素分泌量增加3倍以上,达到(612.1±40.78)μIU/ml；在mRNA和蛋白水平上,laminin 411可以显著提高IPC Pdx1、Ngn3和insulin mRNA和蛋白的表达；laminin 411-IPC组决定性内皮标志物基因SOX17、Foxa2 mRNA表达较UMSC-IPC组明显升高(p0.05)；相关性分析表明,Pdxl和Foxa2 mRNA的表达量与胰岛素的分泌量成正相关(p0.05)。动物实验层面,通过腹腔注射STZ成功构建了1型糖尿病大鼠模型,laminin 411-IPC组IPC输注3天后糖尿病大鼠空腹血糖较UMSC-IPC组明显降低(p0.05)；与UMSC-IPC组比较,laminin 411-IPC组能明显降低HbAlc的水平(p0.05),而和UMSC组比较,laminin 411-IPC组则能显著降低HbAlc的水平(p0.01);Laminin 411-IPC组和UMSC-IPC组均能明显提高糖尿病大鼠生存率和增加体重,但两组无明显差异。安全性方面,没有发现明显不良反应。结论：UMSC在适当条件下能够诱导生成IPC;Laminin 411能提高UMSC-IPC的分化程度及增强其分泌胰岛素的功能,其机制是通过DE途径来发挥作用的；动物实验进一步证实,laminin411-IPC能够有效降低糖尿病大鼠的血糖,改善其临床症状、延长生存期：最重要的是,IPC静脉输注是方便、安全可靠的,为将来替代胰腺p细胞大规模临床应用治疗糖尿病奠定了基础。第三部分：下一步的工作1.临床研究：前期工作中,我们按照入组标准选择18例2型糖尿病病人,静脉输注UMSC,6个月随访结果表明UMSC治疗是安全和有效的；对部分患者能够有效降低血糖、减少降糖药或胰岛素的用量,提高生活质量；为进一步评价远期疗效和安全性,我们将对当前病例继续随访观察。目前临床病例较少,可能影响结果的准确性,下一步我们将积极申报国家干细胞临床研究基地,大规模临床试验来进一步验证治疗效果,并探寻UMSC有效治疗糖尿病及其并发症的机制,为UMSC有效治疗糖尿病提供理论依据。2.基础研究：(1)寻找新型的药物,提高UMSC向IPC的转化效率及增强其胰岛素分泌功能,为体外高效诱导IPC提供新方法,以满足将来大规模临床应用；(2)如何降低IPC的免疫原性,避免植入的IPC遭受免疫系统的排斥,是下一步研究的重点,欲通过以下方式解决：1)采用UMSC来源的IPC：由于MSC具有低免疫原性,推测其来源的IPC也具有低免疫原性,从而降低机体免疫系统对其的损伤；2)将UMSC和IPC联合移植,观察能否进一步降低机体免疫系统对IPC的攻击。3)获得自体的MSC,应用上述方法使其向IPC分化并提高其分化效率和分泌胰岛素的功能,彻底解决免疫排斥问题。(3)与胰岛移植所面临的问题一致,IPC移植同样需要选择比较理想的移植模式,即细胞的移植部位和方式是决定IPC移植是否成功的重要环节,下一步欲比较不同的IPC移植模式(如静脉、皮下和肌注)对IPC存活及血糖的影响,选择最优的移植模式,有效治疗糖尿病。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R587.1

【参考文献】