趋化因子CXCL16对霍奇金淋巴瘤HRS细胞及其背景Treg细胞的作用

发布时间：2017-04-02 03:15

  本文关键词：趋化因子CXCL16对霍奇金淋巴瘤HRS细胞及其背景Treg细胞的作用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma, H L)是西方人群常见的淋巴系统恶性肿瘤,大约占其恶性淋巴瘤11%左右。近年来HL发病率在我国亦有上升趋势。临床上,HL具有较好的预后。经过早期诊断和规范化治疗,大多数HL患者可以达到临床痊愈,但仍有两成患者最终死于肿瘤复发或者进展。组织学上,HL被分为经典型霍奇金淋巴瘤(Classical Hodgkin lymphoma, CHL)和结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤(nodular lymphocyte predominant Hodgkin lymphoma, NLPHL),其中CHL占HL绝大多数(95%左右),又分为4个亚型：结节硬化型、混合细胞型、淋巴细胞丰富型和淋巴细胞消减型。HL具有相当独特的病理形态学特征,即肿瘤的恶性成分即诊断性肿瘤细胞霍奇金/里-斯(Hodgkin/Reed-Sternberg, HRS)细胞仅占肿瘤组织的极少部分(1%),绝大部分为大量非肿瘤性的炎性背景,包括T、B淋巴细胞、中性粒细胞、浆细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、成纤维细胞等。因此,研究HL既要注意肿瘤性HRS细胞,也要关注背景免疫细胞及其细胞因子构成的微环境。肿瘤微环境形成对HL至关重要。研究发现,HRS细胞可分泌多种细胞因子/趋化因子,通过自分泌形式作用于自身表面受体,或者以旁分泌形式吸引和调节背景基质细胞。而其周围的背景炎性细胞也分泌大量细胞因子/趋化因子,反作用于HRS细胞。二者相互作用,形成“对话”,构成一个复杂的分子网络,共同维系HRS细胞的存活、增殖、抗凋亡、迁移以及逃避宿主免疫。HL背景细胞大部分为CD4+T细胞,其中CD4+CD25+调节性T细胞(T regulatory,Treg)作用引人关注。Treg细胞可抑制细胞毒性淋巴细胞(cytotoxic 1ymphocyte,CTL)活性,发挥免疫抑制功能,协助HRS细胞完成免疫逃避。HRS细胞可通过释放某些细胞因子/趋化因子将Treg细胞吸引到自身周围并维持其生存及活化。为了探讨HL微环境形成及相关细胞因子/趋化因子在其中的作用,本课题组前期利用GeneSifter在线软件和BRB-ArrayTools分析平台对公共基因芯片数据库GEO(Gene Expression Omnibus)中的CHL病变组织分离的HRS细胞、CHL细胞株(L428)、Burkitt淋巴瘤细胞株(Raji)以及弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)病人肿瘤组织的基因芯片表达数据分别进行了统计学分析。结果发现除了已阐明的CCL5、CCL22、CCL17、SISd和IL-6等因子以外,新型趋化因子CXCL16及其受体CXCR6也与HL关系密切。进一步比较CXCL16/CXCR6在CHL和DLBCL中表达差异,发现二者表达在CHL中均明显高于DLBCL:利用基因沉默技术建立鼠源性类人霍奇金淋巴瘤模型,其中CXCL16表达明显上调。CXCL16及其受体CXCR6在人霍奇金淋巴瘤的表达和作用究竟如何?这引起了我们的研究兴趣。CXCL16是新近发现的趋化因子,属于CXC家族,具有膜结合型(TM-CXCL16)和分泌型(sCXCL6)两种存在形式。CXCL16主要表达于Th1细胞、NK细胞以及激活的CD8+T细胞以及抗原递呈细胞(antigen-presenting cell,APC)和巨噬细胞等,其受体CXCR6则表达于未分化CD8+T细胞、自然杀伤T(natural killer T, NKT)细胞.CD4+和CD8+T细胞等.CXCL16/CXCR6参与了细胞免疫应答、细胞粘附、抗原递呈、炎症反应以及胸腺T细胞发育等。关于CXCL16的早期报道多集中在炎症及免疫相关疾病中,研究显示CXCL16在诸如动脉粥样硬化、风湿性关节炎、肝炎、肺炎、肾炎以及HIV感染中均扮演了重要作用。近年来,CXCL16及其受体CXCR6在肿瘤中的作用引起研究者密切关注。CXCL16/CXCR6在多种恶性肿瘤中高表达,如结直肠癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肾癌等。报道显示在多数肿瘤中CXCL16表达可促进其生长、转移和复发,但在有些肿瘤中作用却相反。此外,CXCL16/CXCR6还可通过诱导CD4+/CD8+T细胞、自然杀伤细胞等免疫细胞参与抗肿瘤免疫以及肿瘤微环境的形成。虽然CXCL16及其受体CXCR6作为一对趋化因子轴常见表达于免疫细胞如T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞和巨噬细胞等,但其在淋巴造血系统肿瘤中却少见研究。Hanamoto等最早在分析HL中趋化因子表达情况时注意到HL来源细胞株中存在一定程度CXCL16的表达,但未能深入研究这种表达的实际意义。Darash-Yahana在一项炎症相关肿瘤研究中检测了28例淋巴瘤组织中CXCL16的表达情况,其中25%存在CXCL16高表达,但并未提及所研究淋巴瘤组织类型以及这种表达的意义。Deutsch等则注意到CXCL16/CXCR6在淋巴瘤恶性转化中的作用,即胃粘膜相关淋巴瘤(MALT)向弥漫大B淋巴瘤转化过程中常伴随着CXCR6等趋化因子受体表达的上调。我们前期运用荧光定量PCR、免疫印迹、免疫荧光共聚焦以及酶联免疫吸附试验检测了9株淋巴瘤细胞株(7株B细胞来源,2株T细胞来源)中CXCL16/CXCR6基因和蛋白表达情况,以分析不同来源淋巴瘤细胞株中CXCL16/CXCR6表达差异,结果显示CXCL16/CXCR6在淋巴瘤细胞株广泛表达,但不同来源细胞株中其表达水平存在差异,在HL细胞株L428以及某些NHL细胞株(如RPMI-8226、KM3和Jurkat细胞)CXCL16表达相对较高。细胞株是体外条件下培养的单纯肿瘤细胞,缺乏微环境及营养和宿主免疫等影响,与体内肿瘤还存在较大区别。那么,CXCL16/CXCR6在淋巴瘤特别是HL体内肿瘤组织中的表达情况又是怎样?其表达的临床意义如何?CXCL16表达对于HL肿瘤性HRS细胞及其背景细胞的各有何种意义。这些均有待于进一步研究。H/RS细胞表型的形成与CD99基因低表达以及NF-κB信号通路持续活化相关。我们前期研究观察了HL中CXCL16表达与CD99表达相关性以及其与NF-κB信号通路的关系,发现在L428细胞CXCL16表达与CD99表达相反,与NF-κB信号通路活化相关。P13K/AKT信号通路是HL又一重要的信号通路。P13K持续激活后可通过下游AKT和mTOR信号通路,促进HL肿瘤细胞增殖和迁徙。有研究显示CXCL16可激活平滑肌细胞P13K/AKT及NF-κB信号通路,促进其增殖及细胞间粘附。在肿瘤,比如前列腺癌和肝癌中,CXCL16同样可通过激活P13K/AKT信号通路促进其临床进展。那么在HL中,CXCL16表达与这两条通路关系如何,是不是通过这二者在起作用呢?鉴于此,CXCL16及其受体CXCR6在淋巴瘤特别是HL中的表达、意义及其分子机制即是本研究的目的所在。研究目的1.检测CXCL16在淋巴瘤特别是HL组织标本中的表达情况及其临床意义,延伸和完善课题组前期研究；2.研究CXCL16表达对HRS细胞增殖能力、迁移能力、细胞周期、凋亡以及免疫表型等生物学特性的影响,分析CXCL16在HL发生发展中的作用；3.研究CXCL16表达对HL背景Treg细胞的趋化及增殖能力的影响,观察体外共培养条件下Treg细胞与L428细胞相互作用,分析CXCL16在HL微环境形成中可能的作用；4.观察HL肿瘤组织和细胞中P13K/AKT/mTOR信号通路及NF-κB信号通路激活情况及其对肿瘤细胞增殖和迁移的影响,探讨CXCL16表达对上述信号通路的影响,分析CXCLl6对肿瘤细胞作用的分子机制。研究方法1.CXCL16/CXCR6在淋巴瘤组织及细胞中的表达选择70例淋巴瘤(其中45例HL)组织标本,通过免疫组织化学法检测CXCL16及其受体CXCR6蛋白表达情况,并结合相关临床病理资料,分析其临床意义；选择4株淋巴瘤细胞,通过免疫细胞化学方法检测细胞蜡块中CXCL16/CXCR6蛋白表达情况,IPP6.0软件分析阳性细胞光密度值,并与组织中的表达进行对比分析。延伸和完善课题组前期研究。2.CXC16表达对HRS细胞的作用利用慢病毒转染建立过表达CXCL16的L428细胞亚系,并通过外源性添加重组可溶性CXCL16 (sCXCL16)蛋白以及CXCR6抗体分别上调或阻断CXCL16的表达,再通过CCK-8增殖实验、Transwell侵袭实验、PI-Annexin V凋亡检测及流式细胞术等方法,检测肿瘤细胞增殖能力、迁移能力以及细胞周期、凋亡和免疫表型等细胞生物学特性改变。探讨CXCL16表达对HRS细胞的作用。3.CXC16表达对HL微环境形成的影响免疫磁珠法从健康人外周血分离CD4+CD25+Treg细胞,通过Transwell和CCK-8实验检测CXCL16对Treg细胞体外趋化和增殖能力的影响,并观察共培养条件下L428细胞和Treg细胞形态学改变以及各自增殖能力变化。探讨CXCL16表达对HL微环境形成的影响。4. CXCL16对HL肿瘤细胞作用的分子机制首先通过免疫组织化学、免疫细胞化学和Western blot等方法检测HL组织和细胞株中PI3K/AKT/mTOR 和 NF-κB信号通路中关键蛋白AKT、P70S6和IκB磷酸化水平；再观察不同CXCL16表达水平时上述通路活化情况,分析CXCL16表达对上述通路的影响；最后观察单独添加P13K抑制剂LY294002以及联合添加LY294002和sCXCL16对L428细胞增殖和迁移能力影响。结果1. CXCL16/CXCR6在淋巴瘤组织和细胞中的表达(1)淋巴瘤组织中,CXCL16蛋白表达在CHL组要高于NHL组(Z=-2.550,P=0.011)；在CHL组,CXCL16的表达与肿瘤大小有关(Z=-3.327,P=0.001),与性别(Z=-0.038,P=0.970)、年龄(Hc=0.092,P=0.955)、组织学亚型(Hc=1.802,P=0.614)无关；(2)淋巴瘤组织中,CXCR6的表达在CHL组和NHL组无显著差异(Z=-1.850,P=0.064)；在CHL组,CXCR6的表达与肿瘤大小(Z=-1.841,P=0.066)、性别(Z=-0.275,P=0.784)、年龄(Hc=0.894,P==0.640)及组织学亚型(Hc=1.114,P=0.774)等临床病理特征均无显著相关；(3)CXCL16在各淋巴瘤细胞株间表达均存在统计学差异(均P0.05),其中L428的表达最高,其次是Karpass299、Raji和OCI-Ly10；CXCR6在各淋巴瘤细胞株间表达均存在统计学差异(均P0.05),L428的表达最低,其次是Raji、Ly10、和Karpass299；(4)在淋巴瘤组织中,CXCL16与CXCR6蛋白表达呈正相关(相关系数r=0.411,P=0.000),但在淋巴瘤细胞株中二者表达却存在负相关(相关系数r=-0.764,P=0.000)。2.CXC16表达对HRS细胞的作用(1)慢病毒转染过表达CXCL16的L428细胞亚系构建及鉴定构建CXCL16过表达慢病毒载体,稳定转染L428细胞。观察转染后细胞形态学变化,倒置荧光显微镜观察GFP表达证实转染成功。荧光定量PCR检测证实转染亚系CXCL16基因表达上调,免疫印迹检测证实转染亚系CXCL16总蛋白表达上调,ELISA检测证实转染亚系细胞外分泌CXCL16增高；(2)不同CXCL16表达水平下L428细胞增殖能力CCK-8法检测结果显示,除第一天外,其余天各处理组细胞间增殖差别有统计学意义(P0.05)。内源性高表达CXCL16和外源性添加shCXCL16均能有效刺激L428细胞增殖(P0.05),但这两种处理因素之间的刺激作用则差别不明显(P0.05),添加外源性CXCL16受体抗体能降低L428体外增殖能力(P0.05)；(3)不同CXCL16表达水平下L428细胞迁移能力Transwell法检测结果显示,内源性高表达CXCL16和外源性添加sCXCL16均能有效促进L428细胞迁移(P0.05),但这两种处理因素之间的刺激作用则差别不明显(P0.05)；而添加外源性CXCL16受体抗体能降低L428迁移能力(P0.05)；穿膜后细胞继续培养观察证实L428中大细胞可由中等大小细胞转化而来；(4)不同CXCL16表达水平下L428细胞周期变化流式细胞术检测显示,L428细胞与三个处理组细胞周期均存在统计学差异(均P0.001)。内源性过表达CXCL16和外源性添加sCXCL16均可使G1期细胞百分数明显减少,相应处于S期和G2/M期细胞百分数明显升高(P0.05),两个处理组间各个周期细胞百分数则未见有统计学差异(P0.05)；而外源性添加CXCL16受体抗体则可使处于G1期细胞百分数明显升高,S期和G2/M期细胞百分数则明显降低(P0.05)；(5)不同CXCL16表达水平下L428细胞凋亡变化流式细胞术检测显示各处理组L428细胞凋亡率(%)如下：L428裸细胞组为5.69±0.32,L428-CXCL16+组为244±0.41,L428-sCXCL16组为2.37±0.37,L428-anti-CXCR6组为11.62±0.83。L428细胞组与三个处理组细胞凋亡均存在统计学差异(均P0.05),内源性过表达CXCL16和外源性添加sCXCL16均可降低L428细胞凋亡(P0.05),两个处理组间各个周期则未见有统计学差异(P0.05)；而外源性添加CXCL16受体抗体则促进L428细胞凋亡(P0.05)；(6)不同CXCL16表达水平下L428细胞免疫表型变化流式细胞术检测显示不同CXCL16表达水平下L428细胞表面HRS细胞标记抗原CD15.CD30以及B细胞标记抗原CD19和CD20的阳性表达率未见统计学差异(均P0.05)。3.CXC16表达对HL微环境形成的影响(1)添加不同浓度sCXCL16实验组与对照组下室Treg细胞OD值均存在统计学差异(均P0.05)；不同浓度sCXCL16实验组间下室Treg细胞OD值也存在统计学差异(均P0.05),提示sCXCL16对Treg细胞具有趋化作用,其趋化能力随着浓度增加而相应增加；(2)L428细胞和Treg细胞共培养形态学观察：L428细胞成团性增加,细胞体积增大,形态学出现椭圆形、短梭形甚至折角样形态改变；而Treg淋巴细胞在形态和数量变化并不明显,但生存时间延长；(3)CCK-8法检测共培养对L428细胞和Treg细胞增殖的影响,发现共培养时可分别促进二者体外增殖能力(均P0.05)：(4)CCK-8法检测重组人IL-3对L428细胞增殖的影响,发现rIL-3可促进L428细胞体外增殖,而且浓度越高其促增殖能力越强(均P0.05)。4. CXCL16对HL肿瘤细胞作用的分子机制(1)免疫组织化学方法检测HL组织标本中AKT、pAKT、P70S6、pP70S6、pIκB蛋白表达情况,显示在HL组织标本中可检测到AKT/mTOR 及 NF-κB信号通路存在不同程度的磷酸化水平,其中AKT和IκB磷酸化水平较弱,而P70S6磷酸化水平较强；(2)免疫细胞化学方法检测HL细胞株L428中AKT、pAKT、P70S6、pP70S6、 pIκB蛋白表达情况,显示在HL细胞中AKT/mTOR及NF-κB信号通路存在不同程度的磷酸化水平,其中P70S6和IκB磷酸化水平较弱,而AKT磷酸化水平较强；(3)免疫印迹法检测CXCL16不同表达水平下L428细胞AKT/mTOR及NF-κB信号通路磷酸化水平,结果显示外源性和内源性CXCL16表达上升均可提高AKT、P70S6及IκB蛋白磷酸化水平,而中和性CXCL16抗体和CXCR6抗体则可以降低上述通路的磷酸化水平。提示CXCL16可激活L428细胞AKT/mTOR及NF-κB信号通路。(4)免疫印迹法检测外源性SCXCL16对L428细胞AKT/mTO R通路和NF-κB通路磷酸化水平作用与刺激时间的关系,结果显示AKT/mTO R通路磷酸化水平在刺激45分钟即达到峰值,而NF-KB通路磷酸化水平峰值则在刺激60分钟以后；(5)PI3K抑制剂LY294002对L428细胞的影响。外源性添加LY294002可抑制L428细胞体外增殖和迁移能力,且抑制效果与浓度有关,浓度越高抑制越强；当sCXCL16与LY294002联合使用时,LY294002可抑制sCXCL16对L428细胞促进体外增殖和迁移的作用,提示CXCL16对L428细胞的作用可能是通过PI3K/AKT通路起作用。结论1.CXCL16及其受体CXCR6在淋巴瘤中广泛表达,HL组织中CXCL16相对高表达,其表达与肿瘤大小有关；2.CXCL16可促进L428细胞体外增殖及迁移能力,抑制其凋亡,并增加S期和G2/M期细胞比率,但对L428细胞免疫表型无显著影响；3. CXCL16可体外趋化Treg细胞,共培养的Treg细胞和L428细胞可促进彼此增殖；4. CXCL16可能通过激活PI3K/AKT/mTOR及NF-κB信号通路影响L428细胞生物学特性。创新之处1.本研究首次系统探究了趋化因子CXCL16及其受体CXCR6在淋巴瘤组织和细胞中的表达情况,并特别分析了其表达在HL的临床意义,为深入探索HL细胞因子/趋化因子网络奠定了基础；2.本研究通过内源性及外源性调控CXCL16在L428中的表达,系统分析了CXCL16对HRS细胞的作用及其涉及的胞内信号通路,为深入探索HRS细胞分子网络提供了线索,也为HL生物治疗提供了潜在靶点；3.本研究通过体外模拟HRS细胞微环境,初步探究了CXCL16对于HL最重要的背景Treg细胞的作用以及L428细胞细胞与Treg细胞的相互作用,为阐明HL微环境形成提供了线索,也为HL免疫治疗提供了新的思路。
【关键词】：霍奇金淋巴瘤 人HL细胞株L428 霍奇金/里-斯细胞 CXC型趋化因子配体16 CXC型趋化因子受体6 微环境 调节性T淋巴细胞
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R733.1
【目录】：

• 摘要3-12
• ABSTRACT12-27
• 前言27-48
• 一、霍奇金淋巴瘤及其肿瘤微环境27-29
• 二、趋化因子CXCL16及其受体CXCR629-36
• 三、PI3K/AKT/mTOR及NF-κB信号通路与霍奇金淋巴瘤36-40
• 参考文献40-48
• 技术路线48-50
• 第一章 CXCL16/CXCR6在淋巴瘤组织及细胞株中的表达检测50-69
• 一、材料和方法50-53
• 二、结果53-62
• 三、讨论62-64
• 参考文献64-69
• 第二章 CXCL16表达对霍奇金淋巴瘤HRS细胞的影响69-108
• 一、材料和方法69-83
• 二、结果83-102
• 三、讨论102-105
• 参考文献105-108
• 第三章 CXCL16对霍奇金淋巴瘤背景Treg淋巴细胞的影响108-129
• 一、材料和方法108-113
• 二、结果113-123
• 四、讨论123-125
• 参考文献125-129
• 第四章 CXCL16表达与L428细胞PI3K/AKT/mTOR和NF-κB信号通路的关系129-150
• 一、材料和方法129-132
• 二、结果132-144
• 三、讨论144-146
• 参考文献146-150
• 英文缩略词表150-152
• 全文小结152-155
• 附录155-173
• 附录一、人类趋化因子及其受体家族155-158
• 附录二：综述158-173
• 参考文献165-173
• 攻读学位期间研究成果173-175
• 致谢175-178
• 统计学证明178

  本文关键词：趋化因子CXCL16对霍奇金淋巴瘤HRS细胞及其背景Treg细胞的作用，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：281785