气管导管材料表面细菌与真菌混合生物膜形成及真菌密度感应分子对混合生物膜的作用研究

发布时间：2020-09-28 20:40

　　 [背景]随着生物医学材料在临床的广泛应用,以生物材料为中心的感染成为十分常见的医院内感染。尤其是长期气管插管患者引发的生物材料植入相关混合微生物感染,具有难治性、反复性、耐药性等特点,常常导致临床感染迁延不愈,引发灾难性后果。研究表明,表皮葡萄球菌和白假丝酵母菌是引发临床生物材料植入感染的常见条件致病菌。目前,有关生物材料植入引发的混合生物膜感染研究报道甚少。本研究通过建立气管导管材料表面混合生物膜体外模型,为生物材料植入引发的混合生物膜感染研究提供实验模型；研究气管导管材料表面混合微生物生物膜与单一微生物生物膜的差异,为生物材料植入相关混合微生物生物膜感染的防治研究提供新思路；探讨真菌密度感应分子法尼醇(Famesol)、对羟基苯乙醇(Tyrosol)对气管导管材料表面表皮葡萄球菌和白假丝酵母菌混合生物膜的作用,为临床防治生物材料相关混合微生物感染提供帮助。第一部分：气管导管材料表面细菌与真菌混合生物膜形成及相关基因研究[目的]建立气管导管材料表面混合微生物生物膜体外模型；观察气管导管材料表面表皮葡萄球菌和白假丝酵母菌形成的混合微生物生物膜与单一微生物生物膜在生长特性、体外生长动力学、超微结构及基因表达方面的差异。[方法]选用聚氯乙烯气管导管作为实验材料。实验分组：表皮葡萄球菌标准株ATCC35984 (生物膜形成阳性)单独培养组(表葡阳性组)、表皮葡萄球菌标准株ATCC12228(生物膜形成阴性)单独培养组(表葡阴性组)、白假丝酵母菌标准株ATCC10231单独培养组(白念组)、表皮葡萄球菌标准株ATCC35984 (生物膜形成阳性)和白假丝酵母菌标准株ATCC10231混合培养组(阳性混合组)、表皮葡萄球菌标准株ATCC12228(生物膜形成阴性)和白假丝酵母菌标准株ATCC 10231混合培养组(阴性混合组)共5组。建立单一微生物、混合微生物在气管导管材料表面体外生物膜模型,各组分别在培养2h、4h、6h、8h、 24h、48h、72h,用结晶紫染色法检测生物膜形成能力；二甲氧唑黄(XTT)比色法评价生物膜的体外生长动力学；激光共聚焦显微镜观察气管导管材料表面生物膜生长状态；分别于24h、72h扫描电子显微镜观察气管导管材料表面生物膜超微结构；荧光定量PCR分析各组表皮葡萄球菌及白假丝酵母菌生物膜形成相关基因的表达差异。[结果]①.结晶紫染色法检测生物膜形成能力结果：表葡阳性组和阳性混合组均在培养12h起生物膜开始增厚,至培养24h生物膜生长趋于平衡,随培养时间延长生物膜生长再增厚,至培养72h阳性混合组超过表葡阳性组,组间比较除72h其余各时点两组比较差异均有统计学意义(P0.05)；白念组12h出现生物膜生长,在所有时点白念组生物膜厚度均低于阳性混合组(P0.05)。表葡阴性组、阴性混合组在整个培养周期无生物膜形成。②.XTT比色法检测生物膜生长动力学结果：阳性混合组48h前OD值低于表葡阳性组,48h、72h时点OD值高于表葡阳性组,组间比较12h时差异有统计学意义(P0.05)；阳性混合组2h、4h时点OD值低于白念组,差异无统计学意义(P0.05),6h后各时点OD值显著高于白念组(P0.05)。阴性混合组2h、48h时点OD值高于表葡阴性组,其余各时点低于表葡阴性组,组间比较6h、8h时点差异有统计学意义(P0.05)；阴性混合组2h、4h时点OD值低于白念组,其余各时点均高于白念组,组间比较除外2h、4h、72h时点,其余各时点比较差异均有统计学意义(P0.05)。③.激光共聚焦显微镜观察结果：死／活菌染色法阳性混合组生物膜24h基本为活菌,48h以活菌为主的活、死菌交织生长,72h生物膜死菌较前明显增多；阴性混合组24h、48h基本为活菌,72h出现少量死菌。荧光原位杂交阳性混合组培养24h两种微生物生长良好,有少量菌丝形成；培养72h两种微生物较前生长的更为密集,有大量菌丝形成。阴性混合组24h表皮葡萄球菌散在生长,白假丝酵母菌在局部聚集成团状；培养72h表皮葡萄球菌较前有所增多,白假丝酵母菌生长良好,局部有菌丝形成。④.扫描电子显微镜观察结果：培养24h与表葡阳性组表皮葡萄球菌形成的三维立体结构或白念组白假丝酵母菌的孢子及菌丝形成的三维立体结构相比较,阳性混合组表皮葡萄球菌和白假丝酵母菌混杂生长,在孢子及菌丝形成的立体网状结构中混有表皮葡萄球菌,初步形成具有三维空间立体构象的混合生物膜。阴性混合组培养24h见白假丝酵母菌的孢子及菌丝生长,表皮葡萄球菌散在平铺生长,未见明显三维立体结构的生物膜形成。⑤.荧光定量PCR结果：培养72h阳性混合组与表葡阳性组相比,icaA、aap、he基因表达均上调,分别为1.52倍、1.46倍、1.93倍；与白念组相比als3、hwp1基因表达上调,分别为4.22倍、2.56倍。培养72h阴性混合组与表葡阴性组相比,aap、fbe基因表达下调,分别为0.25倍、0.47倍；与白念组相比als3基因表达上调,为2.21倍；hwpl基因表达下调,为0.57倍。[结论]1.生物膜形成阳性表皮葡萄球菌和白假丝酵母菌培养24h能在气管导管材料表面形成由表皮葡萄球菌和白假丝酵母菌混杂生长、结构致密、高度组织化的多细胞群体结构即成熟的混合生物膜。2.生物膜形成阳性表皮葡萄球菌和白假丝酵母菌混合培养,能形成较单一白假丝酵母菌更厚、结构更为复杂的混合生物膜,这可能是导致临床生物材料混合微生物感染迁延不愈重要原因之一；混合生物膜形成过程中,与表葡阳性组相比icaA、aap、fbe基因表达上调,与白念组相比als3、hwpl基因表达上调,可能与混合生物膜结构复杂相关。3.生物膜形成阴性表皮葡萄球菌和白假丝酵母菌混合培养,未较单一微生物形成更厚的生物膜；在培养过程中,aap、fbe、hwpl基因下调,提示生物膜形成阴性表皮葡萄球菌不能促进与白假丝酵母菌混合生物膜的形成。第二部分：真菌密度感应分子对气管导管表面表皮葡萄球菌及白假丝酵母菌混合生物膜形成的影响及其可能机制[目的]探讨真菌密度感应分子Farnesol、Tyrosol对气管导管材料表面表皮葡萄球菌和白假丝酵母菌混合生物膜形成的影响及其可能机制。[方法]选用聚氯乙烯气管导管作为实验材料。将表皮葡萄球菌标准株ATCC35984(生物膜形成阳性)和白假丝酵母菌标准株ATCC10231混合培养,按照给予不同处理因素将实验分为3组,加入真菌密度感应分子Farnesol (DF组)、真菌密度感应分子Tyrosol(DT组)、相同体积的去离子水(DD组),分别于培养2h、4h、6h、8h、12h、24h、48h、72h、96h,结晶紫染色法检测生物膜形成能力；二甲氧唑黄(XTT)比色法评价生物膜的体外生长动力学；激光共聚焦显微镜观察各组生物膜生长状况；扫描电子显微镜观察各组生物膜超微结构；荧光定量PCR分析各组表皮葡萄球菌及白假丝酵母菌生物膜形成相关基因icaA、ap、fbe、 als3、hwp1、efg1等的表达情况。[结果]①.结晶紫染色法检测生物膜形成能力结果：生物膜形成能力检测组间整体比较,在整个培养周期2h-96h,DF组、DT组及DD组三个组整体差异有统计学意义(P0.05)。DD组分别与DF组、DT组比较,生物膜形成能力差异均有统计学意义(P0.05)。2h-96h整个培养周期内,除4h和72h两个时点,DF组生物膜厚度均小于DD组,组间比较显示12h、24h差异有统计学意义(P0.05)。在2h-96h整个培养周期内,除外12h时点,DT组生物膜厚度均大于DD组,组间比较2h、4h、6h差异有统计学意义(P0.05)。②.XTT比色法检测生长动力学结果：生物膜体外生长动力学组间总体比较,在整个培养周期2h-96h,DF组、DT组及DD组三个组整体差异没有统计学意义(P0.05)。2h-96h整个培养周期内,除外72h DF组的生长动力学均小于或等于DD组,组间比较显示4h、48h这两个时间点,差异有统计学意义(P0.05)。在2h-96h整个培养周期内,4h、12h、72h DT组的生长动力学均大于或等于DD组,组间比较12h差异有统计学意义(P0.05)。③.激光共聚焦显微镜观察结果：死／活菌染色法三组生物膜中两种微生物混杂生长,24h基本为活菌,48h为以活菌为主的活、死菌交织生长,72h死菌较48h明显增多。④.扫描电子显微镜观察结果：DD组培养24h表皮葡萄球菌和白假丝酵母菌的孢子、菌丝混杂生长,初步形成具有三维立体结构的混合生物膜；72h表皮葡萄球菌和白假丝酵母菌的孢子、菌丝生长更加密集,混合生物膜结构更加复杂。DF组培养24h表皮葡萄球菌和白假丝酵母菌的孢子混杂生长,未见明显菌丝形成；72h视野内表皮葡萄球菌和白假丝酵母菌的孢子、少量菌丝混杂生长。DT组培养24h表皮葡萄球菌和白假丝酵母菌的孢子菌丝混杂生长,初步形成具有立体三维结构的混合生物膜,表皮葡萄球菌呈团块状、蘑菇样密集生长将孢子及菌丝几乎完全包裹；72h视野内大量表皮葡萄球菌和白假丝酵母菌的孢子及菌丝混杂生长,表皮葡萄球菌黏附在孢子及菌丝表面,将其包裹形成复杂的三维立体结构的混合生物膜。⑤.荧光定量PCR结果：与DD组相比,DF组培养6h icaA、aap、fbe基因下调,分别为0.83倍、0.59倍、0.75倍；培养24haap基因下调,为0.67倍,icaA、fbe基因上调,分别为2.36倍、1.99倍。与DD组相比,DF组培养6h als3、hwp1、eef1基因下调,分别为0.41倍、0.43倍、0.27倍；培养24h als3、hwp1、efg1基因下调,分别为0.14倍、0.06倍、0.79倍。与DD组相比,DT组培养6h和24h icaA、aap、fbe基因上调,分别为1.61倍、1.05倍、1.86倍和25.59倍、17.65倍、21.46倍；培养6h和培养24hDT组als3、hwp1、eef1基因下调,分别为0.27倍、0.26倍、0.30倍和0.79倍、0.59倍、0.65倍。[结论]1.真菌密度感应分子法尼醇在表皮葡萄球菌和白假丝酵母菌混合生物膜形成过程中会产生一定的抑制作用,提示法尼醇或许能成为临床混合微生物生物膜感染治疗的方向；法尼醇能使混合生物膜形成能力下降,生长动力学降低,抑制生物膜结构形成,通过作用于密度感应系统达到影响生物膜形成的作用。法尼醇对icaA、fbe基因的早期下调及als3、hwp1、efg1、aap基因的持续下调,可能是抑制混合生物膜形成机制之一。2。真菌密度感应分子对羟基苯乙醇在表皮葡萄球菌和白假丝酵母菌混合生物膜形成过程中会产生一定的促进作用,寻找适当的方法抑制或减少该密度感应分子的生成,能成为混合微生物生物膜感染控制的新思路；对羟基苯乙醇能提高生物膜形成能力,提高生长动力学,促进生物膜形成。其对生物膜的作用可能是对icaA、aap、fbe基因的上调和als3、hwp1、e fg1基因下调综合作用的结果。
【学位单位】：昆明医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R318.08
【文章目录】：
中英文缩略词对照表
中文摘要
英文摘要
引言
第一部分
    前言
    材料与方法
    结果
    讨论
    结论
    参考文献
第二部分
    前言
    材料与方法
    结果
    讨论
    结论
    参考文献
第三部分
    参考文献
攻读博士期间参与课题
攻读博士期间发表文章
致谢

【参考文献】