穿心莲内酯对人甲状腺未分化癌细胞的生物学特征和阿霉素耐药的作用研究

发布时间：2020-10-28 17:26

　　 背景:人类甲状腺未分化癌(Anaplastic thyroid carcinoma,ATC)进展快,死亡率高,治疗效果较差,其对常用化疗药物阿霉素(Doxorubicin,DOX)耐药一直是临床难题。我们前期研究发现,用阿霉素处理ATC细胞株后,存活少量的肿瘤干细胞(Cancer stem cell,CSCs)是ATC细胞发生耐药的重要因素。因此,寻找合适的抗甲状腺肿瘤及肿瘤干细胞的药物是目前研究的热点。近年研究证实,穿心莲内酯类化合物对肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌等有明显的抗肿瘤作用,且具有抗多发性骨髓瘤肿瘤干细胞的效应。然而,穿心莲内酯对ATC的作用暂无相关报道。纳米技术的发展为肿瘤的诊断和治疗提供了新的方法,我们前期研究也同时发现,多巴胺黑色素纳米粒子(Dopamine-melanin nanoparticles,DMNPs)与DOX结合,可以提高ATC耐药株HTh74Rdox细胞对DOX的摄取能力,改善耐药性。而DMNPs对穿心莲内酯的负载能力及结合后对HTh74Rdox耐药性的改善作用尚不清楚,值得探索。目的:(1)评估穿心莲内酯在抑制甲状腺未分化癌细胞增殖、诱导细胞凋亡、抑制细胞迁徙等方面的效果。(2)探讨穿心莲内酯联合阿霉素化疗增敏方面的价值及可能的作用机制。(3)观察穿心莲内酯对甲状腺肿瘤干细胞的作用及机制。(4)研究DMNPs对穿心莲内酯的装载效率,观察联合穿心莲内酯和DMNPs对甲状腺未分化癌细胞的作用。方法:(1)通过MTT和实时细胞分析观察穿心莲内酯对甲状腺未分化癌细胞株HTh74和阿霉素耐药细胞株HTh74Rdox活性的抑制作用,及穿心莲内酯联合阿霉素对HTh74Rdox活性的抑制作用。(2)通过细胞克隆实验检测穿心莲内酯对HTh74Rdox细胞增殖的影响。(3)通过Caspase-3活性检测、流式细胞技术评价穿心莲内酯对HTh74Rdox细胞凋亡的影响。(4)通过细胞划痕试验观察穿心莲内酯对HTh74Rdox细胞迁徙能力的影响。(5)通过小管形成试验评估穿心莲内酯对肿瘤血管形成的影响。(6)通过qPCR和Western Blot观察不同浓度穿心莲内酯作用后HTh74Rdox细胞中多药耐药通道蛋白MDR1及ABCG2的mRNA和蛋白表达水平。(7)通过qPCR和Western Blot检测不同浓度穿心莲内酯作用后HTh74Rdox细胞中干细胞标志物CD133、Oct-4的mRNA和蛋白表达水平。(8)通过Western Blot检测不同浓度穿心莲内酯作用后HTh74Rdox细胞中MAPK/ERK信号通路中ERK和p-ERK蛋白的表达水平。(9)通过紫外可见分光光度计测定多巴胺黑色素纳米粒子对穿心莲内酯的装载效率。(10)通过MTT检测联合穿心莲内酯和DMNPs对HTh74和HTh74Rdox细胞的活力。结果:(1)穿心莲内酯对甲状腺未分化癌HTh74细胞和阿霉素耐药株HTh74Rdox细胞的活性有抑制作用,穿心莲内酯对HTh74细胞的半数抑制浓度(IC50)为17.2±2.77 μmol/L,而对HTh74Rdox细胞的IC50则为25.9±2.43μmo l/L,并且呈时间和剂量双重依赖性;穿心莲内酯联合阿霉素用药后阿霉素对HTh74Rdox细胞的IC50为629.6±19.87 ng/ml,阿霉素的耐药指数为5.15±0.32,较单药使用时耐药性有明显降低。(2)HTh74Rdox细胞克隆增殖数量随穿心莲内酯浓度增加而降低,当穿心莲内酯浓度达到10μmol/L时,HTh74Rdox细胞的克隆增殖水平显著下降,克隆的有效率为22.3%(P0.01);当穿心莲内酯浓度达到20μmo l/L时,克隆的有效率仅为5%(P0.01)。(3)HTh74Rdox细胞中Caspase-3的活性随着穿心莲内酯浓度的升高而增高,HTh74Rdox晚期凋亡细胞较对照组明显增多,当穿心莲内酯的浓度为20μmol/L时,细胞的晚期凋亡率为21.56%。(4)与对照组相比使用不同浓度穿心莲内酯作用后的HTh74Rdox细胞迁徙能力明显下降,当穿心莲内酯浓度达到10μmol/L时,划痕的开放面积与对照组相比可达126.7%,当穿心莲内酯浓度达到20μmol/L时,划痕的开放面积与对照组相比可达150.3%,此外还出现了细胞死亡现象。(5)与对照组相比使用不同浓度穿心莲内酯作用后HTh74Rdox细胞小管分支数量无明显变化。(6)与对照组相比使用不同浓度穿心莲内酯作用后HTh74Rdox细胞中多耐药通道蛋白MDR1及ABCG2的mRNA和蛋白表达水平明显降低(P0.05),且成剂量依赖性。(7)与对照组相比使用不同浓度穿心莲内酯作用后HTh74Rdox细胞中干细胞标志物CD133、Oct-4的mRNA和蛋白表达水平明显降低(P0.05),且成剂量依赖性。(8)与对照组相比不同浓度穿心莲内酯作用后HTh74Rdox细胞中p-ERK蛋白的表达水平降低(P0.05),且成剂量依赖性。(9)随着多巴胺黑色素纳米粒子和穿心莲内酯质量比的增加,穿心莲内酯的装载效率均维持在一个较低的水平。(10)联合使用穿心莲内酯和DMNPs抑制HTh74和HTh74Rdox的细胞活力,较单独使用穿心莲内酯对ATC细胞的抑制作用无明显差异。结论:(1)穿心莲内酯能抑制HTh74和HTh74Rdox细胞的活性,且对于HTh74Rdox细胞呈药物剂量和时间依赖性;穿心莲内酯可抑制HTh74Rdox细胞的增殖、迁徙,并增加凋亡作用,但对血管形成无明显抑制作用。(2)穿心莲内酯联合阿霉素作用HTh74Rdox细胞有减药增效作用,并且可以通过下调HTh74Rdox细胞MAPK/ERK信号通路中p-ERK蛋白的表达,抑制多耐药通道蛋白MDR1及ABCG2的mRNA和蛋白表达水平。(3)穿心莲内酯能抑制HTh74Rdox细胞干细胞球的形成,降低干细胞标志物CD133、Oct-4的mRNA和蛋白表达水平。(4)多巴胺黑色素纳米粒子对穿心莲内酯的装载效率较低。联合使用多巴胺黑色素纳米粒子和穿心莲内酯较单独使用穿心莲内酯抑制ATC细胞的作用无明显差异。
【学位单位】：南京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

南京中医药大学博士学位论文??Ｒｅｃｅｐｔｏｒ?Ｔｙｒｏｓｉｎｅ?Ｋｉｎａｓｅ?（ＲＴＫ）??＼?／?ＶＥＧＦＲ１－３，?ＲＥＴ，?ＦＧＦＲ１－３??ＦｕｓｍｎＲＴＫｓｇｌ?｜｜＾〇３＆３??Ｍｌ—鱗??ｍＢＫＨ?ＢＢＢＢ??ｌｉｌｊｌ??圓■?４？＊－＾３１????ｍ＾ｍ?１?ＭＭｆｌ??Ｇｒｏｗｔｈ，?Ｓｕｒｖｉｖａｌ，?Ｉｎｖａｓｉｏｎ??图１甲状腺癌中两种最常见的遗传学改变通路：Ｐ１３Ｋ和ＭＡＰＫ??２．１．２?ｐ５３?突变??ｐ５３位于凋亡、侵袭和干细胞相关基因的大型网络的中心。ｐ５３蛋白由核心ＤＮＡ结??合结构域（ＤＢＤ）和调节结构域共同组成，是抗肿瘤发生的主要因子。值得注意的是，??ｐ５３突变不仅取消了肿瘤抑制功能，而且，还经常导致新的致瘤驱动活性，这种负面作??用被称为功能获得（ＧＯＦ）?［５］。ｐ５３突变体通过诸如转化生长因子Ｐ受体（ＴＧＦ－（３），表??皮生长因子受体（ＥＧＦＲ）和原癌基因ＭＥＴ的受体增强信号传导。与野生型ｐ５３不同，??突变ｐ５３蛋白已被证实能够逃避蛋白酶降解，从而导致其在肿瘤中的高度稳定［６１。Ｐ５３??的失活也被认为是晚期甲状腺肿瘤的标志，根据人类癌症体细胞突变数据库（ＣＯＳＭＩＣ）??显示［７］，ＡＴＣ患者中抑癌基因ｐ５３的突变率最高，达到５４％?（图２）。??９??

第一章理论研究??ａ．；％??５４％??馨??■?４１％??１，??３０％?Ｉ?Ｉ??ｎ＇?＇??漏?ｅ?Ｈ?＾?Ｂ?１２％?１１％??１０％?＿?ｈ’?圖■?＿?＿?８％?Ｍ??ＴＰ５３?了ＳＲＴ?ＢＲＡＦ?ＡＸｉＮｉ?ＮＲＡＳ?ＣＴＮＮ８：ＬＰｎ（３ＣＡ?｝＞Ｔ￡Ｎ?ＮＦ１?ＥＪＦＩＡＸ?ＫＲＡＳ?ｆｖＴＴＯＲ?Ｔ￥ＨＲ?ＣＤＫＮ２Ａ?ＨＲＡＳ?ＡＫＴ１?ＴＳＣ２?Ｃ０ＫＮ２Ｃ?６ＧＦＲ??图２甲状腺未分化癌致癌基因突变分布??２．１．３肿瘤干细胞的存在??我们的研究证实，ＡＴＣ细胞株ＳＷ１７３６、Ｃ６４３、ＨＴｈ７４中存在极小比例（０．４１％－０．８３％）??的富含肿瘤干细胞（ＣＳＣｓ）的边缘细胞群（ＳＰ），这小群细胞表达干细胞标志物０ｃｔ４??和耐药蛋白ＡＢＣＧ２、ＭＤＲ１等；在阿霉素诱导耐药的ＨＴｈ７４Ｒｄｏｘ细胞株中，富含肿瘤??千细胞的边缘细胞群的比例显著增加至７０％［８］。此后，我们先后比较二甲双胍与新型抗??肿瘤药物索拉菲尼对ＡＴＣ细胞株及ＣＳＣｓ的效果，结果表明，二甲双胍与索拉菲尼均有??一定的抗肿瘤及ＣＳＣｓ作用。二甲双胍可通过抑制细胞周期、诱导凋亡等途径，有效地．??抑制ＡＴＣ细胞的增殖，减少甲状腺ＣＳＣｓ的克隆形成率，与阿霉素有明显协同作用，可??有效降低阿霉素的耐药，在富含ＣＳＣｓ的耐药株中上述作用更加明显［９］。进一步的研究??提示，在二甲双胍治疗的基础上，索拉菲尼可增强其效果但二甲双胍、索拉菲尼的??使用剂量己远超过临床常规用量，故尚无实际使用价值。因此，仍需进一步寻找有效的??抗ＡＴＣ及ＣＳＣｓ的药物。??２．２穿心莲内酯及其类似物的抗肿瘤效应??２．２．１促进癌细胞周期

〇．〇５表示差异有统计学意义。??４实验结果??４．１穿心莲内酯抑制ＨＴｈ７４、ＨＴｈ７４Ｒｄｏｘ细胞的活力??４．１．１甲状腺未分化癌耐药细胞株ＨＴｈ７４Ｒｄｏｘ具有阿霉素耐药性??不同浓度的阿霉素（０、１、１０、１００、１０００、ｌ〇〇〇〇ｎｇ／ｍｌ）处理?ＨＴｈ７４、ＨＴｈ７４Ｒｄｏｘ??细胞２４小时，从阿霉素浓度为ｌＯｎｇ／ｍｌ开始，ＨＴｈ７４细胞活力就受到明显抑制，且呈明??显的剂量依赖性，而ＨＴｈ７４Ｒｄｏｘ细胞在阿霉素为ｌＯＯＯｎｇ／ｍｌ时细胞活力才开始受到抑制??（图１）。通过ＧｒａｐｈＰａｄ７软件计算得出在ＨＴｈ７４细胞中阿霉素的半数抑制浓度（ＩＣ５０）??为?１２２．５?±６．８９ｎｇ／ｍｌ，而对于?ＨＴｈ７４Ｒｄｏｘ?细胞，阿霉素的?ＩＣ５〇?则高达?２０１１．７士?８５．０１?ｎｇ／ｍｌ，??ＨＴｈ７４Ｒｄｏｘ细胞对阿霉素的耐药指数为１６．４５±?１．０８。??１２５ｎ??■?ＨＴｈ７４??＾?１００￣?１?１?Ｏ?ＨＴｈ７４Ｒｄｏｘ??｜７５｜?Ｉ?Ｉ?ｉｌｌ?ｈ??“ｉｌｉｕｍ??Ｄｏｘ（ｎｇ／ｍｌ）?ｏ?１?１０?１００?１０００?１００００??图１?ＨＴｈ７４Ｒｄｏｘ细胞的阿霉素耐药性??３５??
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本文编号：2860384