子痫前期胎盘组织环状RNA表达谱分析及初步应用研究

发布时间：2020-10-28 10:55

　　 研究背景与目的:子痫前期(preeclampsia,PE)特指妊娠20周后出现的以高血压和蛋白尿为主要特征,可累及脑、眼、肝、肾等多个器官的妊娠期特有疾病~([1])。子痫前期是妊娠期特有的并发症,也是导致孕产妇及围生儿死亡的主要原因之一。目前子痫前期的发病机制尚未完全明确,但大多数患者在胎盘娩出后表现为临床症状和体征逐渐消失~([2]),故推测胎盘的病理改变与子痫前期发病之间存在关联。现有研究已证实多种血清学指标与子痫前期发病之间存在相关性,但仍缺乏特异性的检测指标用于该疾病的早期筛查和疾病严重程度的预测~([3])。环状RNA(circular RNA,circRNA)是一类不具有5’末端帽子和3’末端poly(A)尾,并以共价键形成环形结构的非编码RNA分子~([4])。因其呈封闭的环状结构,不易被核酸外切酶RNaseR降解,因此它比线状RNA更稳定~([5])。环状RNA具有多种生物学功能,可以通过充当微小RNA(micro RNA,miRNA)海绵、与RNA结合蛋白(RNA binding protein,RBP)结合及调节亲本基因表达等参与多项生命活动的调控~([6])。近年研究证实,子痫前期孕妇与正常妊娠孕妇相比环状RNA表达谱存在明显差异~([7]),这些差异表达的环状RNA分子可能参与了子痫前期的发病过程。目前环状RNA在子痫前期发病过程中的机制研究仍较少,本课题拟对子痫前期患者胎盘组织环状RNA表达谱进行鉴定和分析,并对目标分子hsa_circ_0015383的作用机制进行初步探索,最后评价hsa_circ_0015383作为子痫前期早期诊断生物标志物的价值,旨在为子痫前期的预防和治疗提供新的研究思路。研究方法:1、根据严格的纳入及排除标准,选择子痫前期病例及年龄、孕周、孕产史、孕前BMI与之相匹配的正常妊娠病例各5例,采用高通量测序技术鉴定胎盘组织环状RNA表达谱,采用DeSeq2筛选差异表达基因,随后采用多种生物信息学技术对差异表达的环状RNA分子进行分析。2、检测30例子痫前期胎盘及30例正常妊娠胎盘中hsa_circ_0015383、Wnt5a和β-catenin蛋白表达水平的差异。构建SiRNA转染HTR-8/SVNEO细胞模型,通过MTT细胞增殖实验、Transwell细胞迁移和侵袭实验及血管生成实验,了解hsa_circ_0015383对细胞功能的影响。3、RT-PCR法检测31例子痫前期孕妇及78例正常孕妇孕20周时血清hsa_circ_0015383的表达水平,根据RQ值绘制ROC曲线并计算曲线下面积,评价hsa_circ_0015383用于子痫前期早期诊断的价值。研究结果:1、在10例胎盘样本中,我们共检测到了5038个环状RNA表达丰度。以P0.05,差异倍数≥1.5倍作为差异基因筛选标准,共得到差异表达的环状RNA分子277个,包括130个高表达的和147个低表达的环状RNA分子。对差异环状RNA来源基因进行G0和KEGG通路富集分析,提示在内质网蛋白加工、磷脂代谢、RAS信号通路等方面存在明显富集现象。2、子痫前期患者胎盘组织中hsa_circ_0015383表达水平上调(P0.05),这一结果与测序结果一致。应用SiRNA下调hsa_circ_0015383后,HTR-8/SVNEO细胞中Wnt5a和β-catenin蛋白表达水平升高,细胞的迁移、侵袭、成管能力增强(P0.05),而细胞增殖能力无明显改变(P0.05)。3、hsa_circ_0015383在子痫前期孕妇孕20周时血清中的表达水平高于正常妊娠孕妇(P0.05),预测子痫前期的曲线下面积为0.813,灵敏度为0.742,特异度为0.756。结论:1、与正常妊娠胎盘相比,子痫前期胎盘组织中存在异常表达的环状RNA,这些异常表达的环状RNA分子可能通过某些通路参与子痫前期的发病过程。2、hsa_circ_0015383在子痫前期患者胎盘组织中呈高表达,且其表达水平与Wnt5a和β-catenin蛋白表达水平呈负相关。hsa_circ_0015383可能通过与hsa-miR-197结合对Wnt信号通路起负性调节作用,进而影响EVTs细胞迁移、侵袭和成管能力,最终参与子痫前期发病。3、hsa_circ_0015383对子痫前期的早期诊断具有一定的价值,未来有望成为子痫前期新的生物标志物。
【学位单位】：南昌大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R714.244
【部分图文】：

先前研究中,环状RNA被认为是一类独特的非编码RNA。近期研究表明,一种名为circZNF609的新型环状RNA含有开放阅读框(open reading frame,ORF),当被IRES驱动时可在小鼠成肌细胞中翻译成蛋白质。Yang等[47]研究发现,circFBXW7编码一种新型功能蛋白FBXW7-185a,可通过减少c-Myc抑制胶质瘤发生。尽管已认识到环状RNA具有翻译功能,但这些环状RNA编码的蛋白质的功能仍需进一步研究。在妇产科领域,对环状RNA的研究起步较晚,环状RNA与子痫前期相关性的研究仍较少,在子痫前期发病机制中的作用还需不断探索。在本试验中,我们将采用高通量测序技术对子痫前期患者胎盘组织中环状RNA表达谱进行鉴定,并从中选出目标分子进行后续机制研究,旨在为子痫前期的早期诊断提供新的生物学标记物,为子痫前期的预防和治疗提供新的切入点。

在本部分试验中,我们将采用基于Illumina测序平台的高通量测序技术对子痫前期患者胎盘组织中环状RNA表达谱进行鉴定,测序生物信息分析流程见图1-1。具体步骤如下:

对照组中,胎盘绒毛少见合体细胞结节和纤维性坏死,血管合体膜绒毛较多;而研究组胎盘组织中,绒毛合体细胞结节增多,毛细血管充血、纤维性坏死较多,血管合体膜绒毛少,见图1-2。二、RNA质检结果
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本文编号：2859995