护肝片对利福平导致肝损伤的保护作用及机制研究

发布时间：2020-10-28 08:41

　　 研究目的以内质网应激信号通路为研究靶点,开展护肝片对抗结核药物导致肝胆湿热证药物性肝损伤患者治疗效果以及护肝片中主药五味子所含有的有效成分——五味子乙素对抗结核药导致的正常肝细胞损伤的保护作用的研究。探讨护肝片调控内质网应激信号通路治疗药物性肝损伤的机制。研究方法1.临床实验本研究采用回顾性的研究方法,按照治疗方法不同将纳入研究的68名抗结核药物导致肝胆湿热证药物性肝损伤的患者分为治疗组和对照组。两组患者均采用“2HRZE/4HR”方案进行抗结核治疗,对照组给予单纯多烯磷脂酰胆碱胶囊口服治疗。治疗组在对照组治疗的基础上,加用护肝片口服治疗。疗程为14天。两组治疗期间,观察两组患者:①中医证候指标改善情况,·②肝功能相关化验指标:丙氨酸氨基转移酶、总胆红素、碱性磷酸酶、国际标准化比值的改善情况;③人血清内质网应激通路相关蛋白的检测指标:GRP78、IRE1、PERK、ATF6及CHOP蛋白含量变化情况。2.体外细胞实验①使用不同浓度的五味子乙素(0、25μM、50μM、100μM、200μM、400μM)和利福平(0、25μM、50μM、100μM、200μM、400μM)处理人正常肝 L02 细胞 48h,通过 MTT实验确定五味子乙素的保护浓度和利福平的造模浓度。选择五味子乙素50μM为细胞保护浓度,利福平200μM作为细胞造模浓度。②实验分组:对照组:L02细胞不作任何处理;利福平组:给予L02细胞200μM利福平;利福平+五味子乙素组:L02细胞给予50μM五味子乙素和200μM利福平。处理0-72h,MTT实验检测L02细胞的存活率。③200μM利福平处理L02细胞12 h、24 h和48 h,观察内质网应激通路相关蛋白和基因表达情况。④实验分组:对照组:L02细胞不作任何处理;利福平组:200μM利福平处理L02细胞48h;利福平+五味子乙素组:200μM利福平和不同浓度五味子乙素(25μM、50μM、100μM)处理L02细胞48h,采用WB、qRT-PCR、流式细胞方法分别检测各组L02细胞内质网应激通路相关蛋白、基因表达和细胞凋亡情况。⑤实验分组:对照组:L02细胞不作任何处理;利福平组:给予L02细胞200μM利福平;利福平+五味子乙素组:L02细胞给予100μM五味子乙素和200μM利福平。作用48 h后,采用免疫荧光染色方法检测上述各组L02细胞内质网应激通路相关蛋白表达。研究结果1.临床实验①治疗组与对照组相比,中医证候疗效明显优于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。②治疗组与对照组相比,患者治疗前后中医症状积分改善情况明显优于对照组。③治疗组治疗1周后,与治疗前相比,ALT、ALP明显下降,差异有统计学意义,TBIL、INR与治疗前相比差异无统计学意义。结果与对照组治疗1周后相比,仅ALT改善更明显,差异有统计学意义,ALP改善无显著性差异。治疗组治疗2周后,与治疗前相比,除ALT、ALP外,TBIL水平开始下降,与治疗前相比差异有统计学意义,与对照组治疗2周后相比,TBIL改善更明显。INR改善与本组治疗前、对照组治疗2周后相比差异仍无统计学意义。④两组患者治疗前血清中内质网应激通路相关蛋白GRP78、IRE1、PERK、ATF6及CHOP表达明显增加。治疗组治疗1周后,患者血清中GRP78、IRE1、PERK、ATF6及CHOP表达仅轻度下降,差异无统计学意义(P0.05)。治疗组治疗2周后,患者血清中GRP78、IRE1、PERK、ATF6及CHOP表达较治疗前明显下降。而对照组患者治疗1、2周后,血清中GRP78、IRE1、PERK、ATF6及CHOP表达均未出现明显下降。治疗2周后,治疗组比较对照组,患者血清中GRP78、IRE1、PERK、ATF6及CHOP表达下降,差异有统计学意义。2.体外细胞实验①利福平+五味子乙素组,比较利福平组,L02细胞的存活率显著提高,表明五味子乙素可以减少利福平对L02细胞的损害。②利福平可以激活内质网应激通路并促进GRP78、PERK、ATF4、CHOP、ATF6、ARMET、p-IRE1 和 XBP-1 的蛋白质表达,同时,利福平促进基因GRP78、PERK、ATF4和CHOP mRNA表达水平,呈时间依赖性。③WB、qRT-PCR方法提示五味子乙素可以有效地抑制利福平激活的内质网应激通路,下调GRP78、PERK、ATF4、CHOP、ATF6、ARMET和XBP-1蛋白和基因的表达水平,且抑制作用与五味子乙素浓度呈正相关。④流式细胞术和WB方法提示五味子乙素能有效抑制利福平诱导的L02细胞凋亡,降低凋亡蛋白PARP和Cleaved caspase3的表达,且这种抑制作用与五味子乙素浓度呈正相关。⑤免疫荧光染色方法提示五味子乙素可以有效地抑制利福平激活的内质网应激通路,下调L02细胞核内GRP78、PERK、ATF6、p-IRE1和XBP-1蛋白表达水平。研究结论①护肝片可以有效改善肝胆湿热证药物性肝损伤患者中医证候。②护肝片可以有效改善肝胆湿热证药物性肝损伤患者肝功能相关指标:丙氨酸氨基转移酶、总胆红素、碱性磷酸酶。③护肝片可以有效地抑制内质网应激通路相关蛋白的表达,对抗结核药物导致的药物性肝损伤起到治疗作用。④五味子乙素能够有效地提高利福平损伤的肝细胞存活率,减少细胞凋亡,同时可以下调 GRP78、PERK、ATF4、CHOP、ATF6、ARMET 和 XBP-1 的表达水平,抑制利福平激活的内质网应激通路,且抑制效果与其作用浓度呈正相关性。提示其保肝机制可能是通过抑制内质网应激通路来实现。
【学位单位】：南京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R575
【部分图文】：

ＡＦＬＤ大鼠对ＣＣ１４诱导的肝损伤的敏感性，改善大??鼠肝功能，减少肝脏脂肪堆积［３５］。研究表明内质网应激抑制剂可以减轻乙醇诱导的急性肝??损伤和血清外泌体ｍｉＲ－１２２的表达，为急性酒精性肝损伤提供了潜在的治疗策略［３６］。对于??全氟辛烷磺酸诱导的肝损伤，通过抑制炎症反应和内质网应激，维生素Ｃ也可以起到对小??鼠的肝保护作用［３７］。??高尔基休??：：??…ｇ＇：臟始麵－ｒ??’?二?點合成＿分悉自、議５、為网关??［ＡＪ?Ｈ?联降解通路及凋亡相关Ｂ因转??录激活??图１－２内质网应激信号通路图??（来源于?Ｄｕｆｏｕｒ?ＪＦ．?Ｃｌａｖｉｅｎ?ＰＡ，?Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ?Ｐａｔｈｗａｙｓ?ｉｎ?Ｌｉｖｅｒ?Ｄｉｓｅａｓｅｓ?［Ｍ］，?Ｎｅｗ?Ｊｅｒｓｅｙ：??Ｗｉｌｅｙ－ＢＩａｃｋｗｅｌｌ，?２０１５．?ｐ．?１４１）??１．３．２特异质肝毒性??肝脏除了是解毒器官，又是免疫器官。在部分特异性个体中，药物或其代谢产物在肝??脏中与特异性肝内蛋白结合，形成新的抗原，使机体产生免疫应激反应，导致特异质肝毒??性损伤。临床上，阿莫西林、磺胺甲恶唑、异烟肼等抗微生物制剂，可以激活人体免疫反??应，造成肝细胞损害。同时，研宄表明肝损害与药物的给药剂量、途径、时间并无明确关??系，而且很少重复出现【３８￣３９】。酪氨酸激酶和ＴＮＦａ抑制剂这些分子靶向治疗药物也有诱导??７??

?南京中医药大学博士学位论文???３．２护肝片的质量评定??药典规定是取以五味子乙素对照品，加甲醇制成每ｌｍｌ含Ｉｍｇ的溶液，作为护肝片的??对照品溶液［ＩＱ８］进行质量评定。现代药理学采用高效液相色谱法（Ｈｉｇｈ?Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ?Ｌｉｑｕｉｄ??Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＨＰＬＣ）对护肝片的多成分进行含量鉴定，发现五味子乙素的含量在护肝??片的有效成分中属于含量偏高者［１２（Ｕ２１］（图１－２）。并且五味子乙素的保肝护肝研究是现在??医学研宄的热点［１２２４２５］。??｜?（?Ｉ?３?．１??Ｊ??－?Ｉ＿ｋ＿＿＿－?ｉＪ??????——?１?ｉｒｉｎｍ??０?ｔｏ?２０?３０?４０?５０??１．腺苷?２．五味子醇甲?３．五味子酯甲?４．五味子甲素?５．五味子乙素??图１－２?ＨＰＬＣ色谱图??（来源于伍国怡．ＨＰＬＣ同时测定护肝片中５种成分的含量［Ｊ］．中国药师，２０１６，１９：??８７４）??总之，药物性肝损伤在临床上并不少见，且对患者的身体造成危害，严重时危及生命，??如何找到一个行之有效且无毒副作用、简单易行的治疗方法显得尤为重要。祖国传统中医??药运用整体观念、辨证论治，在防治肝损伤方面有其特色和优势，具有广阔应用前景。护??肝片是在临床多次验证有效的保肝护肝的中成药，但其如何达到治疗效果的分子机制，以??及其所含的有效成分如何作用人体尚不十分清晰。因此，本研究在中医药理论指导下，结??合现代医学和分子生物学技术，深入探索护肝片防治ＤＩＬＩ的机制，以利于该药更好地服??务于患者，是本研究的初衷。??１５??

ｗ：?ａ??ｆ＾ｒｒ．?＝?目三?七三?■??〇?￣￣—?０?■■＊—■■■■■■?＇?＊＊?－??〇ｄ?？ｄ?１４ｄ?〇ｄ?７ｄ?１４ｄ??Ｃ?Ｄ??＊＊??６０－．?Ｉ?１?？？?２．°－??？？－?ｊｆ１］?ｉＰｉ?ｒ１！?，?１６－?ｇｒ＇ｎ?Ｓｒ－ｎ??“画圍ｉ?Ｊ１Ｄ？塵薩１??＂圍圍圍。１麵画??〇１?ＨＩ?＼—旨?Ｌ－Ｊ—圓?１?１?■?〇〇?Ｉ?圉?Ｉ」—旨?ｆ?—昌?Ｉ?ｉ??０ｄ?７ｄ?！４ｄ?０ｄ?７ｄ?１４ｄ??图２－１两组患者治疗前后肝功能指标变化情况比较ｒｐ＜０．０５，?？Ｐ＜０．０１）??３．５两组患者治疗前后人血清内质网应激通路相关蛋白指标的比较??两组患者治疗前血清中内质网应激通路相关蛋白ＧＲＰ７８、ＩＲＥ１、ＰＥＲＫ、ＡＴＦ６及ＣＨＯＰ??表达明显增加。治疗组治疗１周后，两组患者血清中ＧＲＰ７８、ＩＲＥ１、ＰＥＲＫ、ＡＴＦ６及ＣＨＯＰ??表达仅轻度下降，差异无统计学意义（Ｐ＞〇．〇５）。治疗组治疗２周后，患者血清中ＧＲＰ７８、??ＩＲＥ１、ＰＥＲＫ、ＡＴＦ６及ＣＨＯＰ表达与治疗前明显下降，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１）。而??对照组治疗１、２周后，患者血清中ＧＲＰ７８、ＩＲＥ１、ＰＥＲＫ、ＡＴＴ６及ＣＨＯＰ表达均未出现??明显下降（Ｐ＞０．０５）。治疗２周后，治疗组比较对照组，患者血清中ＧＲＰ７８、ＩＲＥ１、ＰＥＲＫ、??ＡＴＦ６?及?ＣＨＯＰ?表达下降差异有统计学意义（Ｐ＝０＿０３０、Ｐ＝０．０２８、Ｐ＝０．０００、Ｐ＝０．００４、Ｐ＝０．０００）??（表?２－６、图?２－２）。??３１??
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本文编号：2859854