紫檀芪对砷诱导表皮细胞损伤的保护作用及分子机制研究

发布时间：2020-10-27 13:18

　　 砷元素是地壳中的常见化学元素之一,对人类的健康具有一定程度的危害。砷元素的无机形态,尤其是三价氧化态的亚砷酸钠(NaAsO_2)和三氧化二砷(As2O3)等的毒性很强。以往的研究表明,长期摄入砷元素含量超标的饮用水会增加罹患皮肤癌、肺癌、肝癌、肾癌在内的多种类型癌症的发病风险。此外,人体接触砷元素还会引发如Bowen’s病、色素沉着异常等在内的多种皮肤损伤。值得注意的是,砷暴露引发的皮肤损伤具有5-10年的潜伏期,且在砷暴露停止后的数十年内相关的疾病仍旧会进一步加重,提示对于砷元素的毒性需要长期预防。当砷元素进入机体后,能够引起细胞氧化应激,进而导致活性氧(ROS)升高、细胞活力下降、引发DNA损伤及细胞突变、细胞凋亡。Nrf2是细胞维持氧化还原稳态和对抗氧化应激损伤的关键转录因子,能够调节包括血红素氧合酶1(HO-1)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、醌氧化还原酶1(NQO-1)和超氧化物歧化酶(SOD)在内的多种抗氧化酶的表达。有研究表明,Nrf2在细胞抗无机砷诱导的氧化应激损伤过程中发挥了关键作用,Nrf2的激活及其调节的细胞抗氧化物质可以保护Ha Ca T细胞免受砷诱导的细胞凋亡和细胞毒性损伤。因此,激活Nrf2的表达是对抗砷诱导细胞损伤的关键。一些前期研究证明了天然化合物紫檀芪(Pterostilbene,Pts)具有优秀的抗氧化作用。紫檀芪可以降低包括过氧化氢和超氧阴离子在内的活性氧活性;可以使得不同细胞系过氧化氢酶的表达增加,如总谷胱甘肽、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶,超氧化物歧化酶等。紫檀芪可能通过激活Nrf2等多个相互关联的机制发挥其抗氧化作用。通过抗氧化作用,Pts能够调节并改善靶细胞的抗氧化应激水平,保护细胞免于各种因素导致的细胞凋亡、坏死等细胞损伤。因此,在这项研究中,我们通过细胞活性试验研究了Pts对NaAsO_2诱导的细胞毒性的保护作用;通过DCFH-DA荧光检测方法检测了Pts对NaAsO_2诱导的细胞内ROS水平升高的缓解作用;通过检测细胞内丙二醛(MDA)和超氧化物岐化酶(SOD)水平,测定了Pts的抗氧化作用;通过JC-1法检测线粒体膜电位水平研究了Pts对NaAsO_2诱导的线粒体损伤的保护作用;通过免疫印迹法检测了Pts对细胞色素C(Cytochrome C)表达的调节作用;通过流式细胞术检测了Pts对NaAsO_2诱导的细胞凋亡的抑制作用。之后,在体内试验中,我们给予小鼠自由饮用含有NaAsO_2的饮水进行染毒,之后给予不同剂量的Pts对小鼠进行治疗,通过检测小鼠在实验期间的体重变化、脏器系数变化、肝脏及皮肤的病理组织学变化、脾脏及胸腺淋巴细胞亚群的变化等指标,研究了Pts对NaAsO_2诱导的小鼠亚慢性砷中毒模型的保护作用;进一步,我们通过研究Pts对NaAsO_2诱导的细胞内线粒体功能和凋亡相关蛋白的调节作用确定了Pts的作用靶点;最后通过si RNA转染技术敲低了Nrf2的表达,研究了Pts对NaAsO_2诱导细胞损伤的保护作用机制。结果表明:Pts在受试浓度范围内对细胞活力无显著影响,但对NaAsO_2诱导的细胞毒性具有极显著的保护作用。进一步研究发现,Pts可以降低由NaAsO_2诱导的细胞内ROS水平的升高、降低NaAsO_2诱导的细胞内MDA水平、提高细胞内的SOD水平、降低线粒体膜电位去极化率、抑制NaAsO_2诱导的线粒体中细胞色素C(Cytochrome C)向胞质部分的释放、显著抑制NaAsO_2诱导的细胞凋亡和坏死,进而对细胞产生保护作用。体内试验中,我们发现Pts能够缓解NaAsO_2染毒后造成的小鼠增重下降及小鼠肝脏系数下降、缓解NaAsO_2染毒后造成的小鼠肝脏损伤及皮肤角质化,并显著逆转NaAsO_2染毒造成的小鼠脾脏及胸腺淋巴细胞CD4/CD8的比值下降,保护小鼠的免疫功能。进一步研究发现,Pts可诱导腺苷酸激活蛋白激酶(AMP-activated kinase,AMPK)和AKT磷酸化,使Nrf2从细胞质向细胞核转移,上调Nrf2下游NQO1和HO-1的表达;Pts可以上调NaAsO_2抑制的抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl的蛋白表达,下调NaAsO_2激活的促凋亡相关蛋白Bax、Bad和Caspase 3的蛋白表达。在Nrf2敲低的细胞中,Pts对NaAsO_2诱导的细胞毒性及ROS生成的抑制作用大幅减弱,说明Nrf2是Pts发挥抗氧化作用的关键蛋白,Pts通过激活Nrf2途径发挥对NaAsO_2诱导细胞损伤的保护作用。在本研究中,我们发现了Pts对NaAsO_2诱导的表皮细胞损伤具有显著的保护作用,能够缓解NaAsO_2染毒对小鼠造成的危害,保护小鼠的免疫功能。进一步研究发现,Nrf2是Pts发挥上述作用的关键转录因子,Pts通过激活Nrf2信号通路并调节抗氧化物质的表达,从而保护细胞免于NaAsO_2诱导的细胞损伤。我们的研究对Pts的抗氧化作用提供了研究基础。Pts在预防和治疗由砷暴露引起的皮肤损伤和其他疾病方面具有潜在的应用价值。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

Nrf2由nuclear factor,erythroid-derived 2-like 2(NFE2L2)基因编码,含有6个结构域(图2.1)[86],其中Neh1区域含有一个碱性亮氨酸拉链(basic region-leucine zipper,bZIP),当Nrf2转位进入细胞核内,bZIP有助于Nrf2与小Maf蛋白(small Maf proteins,sMafs)形成二聚体,并能够帮助Nrf2识别并结合抗氧化反应原件(antioxidant-response-element,ARE),进而启动下游相关基因的转录。Neh2及Neh6是降解决定子,其中,Neh2含有两个保守的区域DLGex和ETGE,是Nrf2与Keap1的结合区,有助于Nrf2与Keap1的结合,并帮助Nrf2稳定存在于细胞质中不被降解;而Neh6是Nrf2与β-TrCP的结合区。Neh3位于C端,与ARE对相关基因转录的调控过程相关。Neh4和Neh5区是参与启动下游相关基因转录的结构域,当Nrf2转位进入细胞核内,需要Neh4及Neh5负责激活Nrf2依赖的转录过程[87-89]。作为细胞抗氧化应激反应的主要调节剂,Nrf2的表达受到严格的调控。在健康条件下,Nrf2的mRNA持续表达,使得Nrf2的表达控制在蛋白水平[90]。蛋白翻译之后,Nrf2主要存在于细胞质中,和Kelch-like ECH-associated protein1(Keap1)结合,形成抑制自身活性的复合物。当受到外界因素(如亲电子物质或者ROS等)刺激时,刺激因素修饰Keap1的半胱氨酸残基,使得Keap1的空间构象发生改变,进而使得Nrf2-Keap1的复合物发生解离,释放出Nrf2[91]。Nrf2转位进入细胞核以后,和ARE结合,继而激活下游相关基因的转录,表达产生一系列抗氧化应激相关的蛋白质,有助于细胞对抗氧化应激造成的细胞损伤[92]。

Nrf2在调节线粒体功能中具有重要作用。研究表明,Nrf2参与线粒体膜电位的调节以及ATP的合成。在一份来自于原代小鼠肝脏细胞的蛋白质组学分析研究中,Nrf2的激活能够调节ATP合酶α亚基的表达[106]。在氧化应激条件下,Nrf2介导的解偶联蛋白3的表达能够提高线粒体内膜的质子传导率,从而减少超氧化物的形成[107]。当Nrf2缺失时,苹果酸酶1、异柠檬酸脱氢酶1、葡萄糖6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡糖酸脱氢酶的表达降低,进而导致NADPH的表达水平降低。HADPH的表达水平降低进一步引起细胞内氧化型谷胱甘肽转变为还原性谷胱甘肽的效率降低,导致细胞转化为氧化态,最终引起炎症及细胞死亡[108,109]。Nrf2在线粒体的生物发生过程中也很重要。有研究表明,在缺乏Nrf2的肝脏细胞中,线粒体DNA的数量明显低于野生型细胞内线粒体DNA的数量[110]。此外,Nrf2对于线粒体的完整性具有调控作用,研究发现,通过给予Nrf2激活剂萝卜硫素处理,能够保护大鼠脑部来源的线粒体免于过氧化物诱导的线粒体通透性的增加,且这一保护作用与萝卜硫素作用下的线粒体谷胱甘肽、谷胱甘肽过氧化物酶1、苹果酸酶3和硫氧还蛋白2的增加密切相关[111,112]。在动物体内,敲除nrf2基因的小鼠虽然能够正常发育,但是对外界氧化性刺激的敏感性大幅提高,提示Nrf2在小鼠抗氧化应激过程中扮演关键角色[113,114]。最后,在氧化应激过程中,Nrf2也能够通过调节细胞自噬体的降解作用来清除受损的线粒体,充分说明了Nrf2在线粒体调控中具有重要的作用[115,116]。

紫檀芪(Pterostilbene,Pts)是一种多酚类化合物,属于白藜芦醇的二甲基化衍生物,主要存在于蓝莓、葡萄、花生、紫檀等植物中,相较于其同系物白藜芦醇,Pts具有更高的亲脂性、更好的生物利用度及更优秀的生物学活性[124-127]。近年来,研究发现Pts具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、降血脂、降血糖等多种有益于人体健康的生物学活性,是天然化合物抗氧化研究的热点[128-141]。3.1 紫檀芪的药理作用
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本文编号：2858573