表达组氨酸脱羧酶的髓系来源抑制性细胞促进管腔型乳腺癌基底细胞样转变和转移的分子机制研究

发布时间：2020-10-31 13:12

　　 研究背景和目的:乳腺癌(Breast cancer,BC)是世界上导致女性癌症相关死亡率的第二大原因,并且超过90%的病例是死于转移。为了形成转移病变,恶性肿瘤细胞必须从原位肿瘤脱离,侵入周围的间质组织,进入循环系统并存活,最终成为循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)。这一过程又称之为集体侵袭(collective invasion),是临床靶向治疗的重要窗口期,因为它可以在明显临床症状出现前就发生。BC组织是高度异质性的,包含多种细胞成分。基于转录组(trascriptome)的分析表明即使是肿瘤细胞也有不同免疫表型,BC因此可以主要分为3个亚型:管腔型(激素受体阳性)、HER2过表达型(HER2阳性,激素受体阴性)和三阴型乳腺癌(HER2和激素受体阴性)。值得注意的是,BC的进展伴随着细胞活动能力(motility)和间质侵犯力的增强。在临床病例和动物模型中发现,与其他肿瘤细胞相比,处于侵袭性边缘或集体侵袭过程的癌症细胞具有不同的免疫表型。大量的研究证实细胞角蛋白14(cytokeratin 14,CK14),一种正常乳腺发育所必须的蛋白质,可以赋予肿瘤细胞一种保守的向基底细胞转变的能力。乳腺胚胎斑中的迁徙细胞表现为CK14~+CK8~+SMA~-。正常乳腺成体干细胞和具有显著侵袭性的癌症细胞,而不是相对比较惰性的癌症细胞,可以高表达CK14。尽管正常导管细胞不表达CK14,导管型肿瘤细胞重新表达CK14有助于转移的发生。但其中的分子调控机制仍不清楚。正常发育过程中,Wnt/β-catenin信号通路在调控包括干细胞多能性和分化能力等细胞生物学行为过程中具有重要作用。Wnt/β-catenin信号通路的异常激活可以导致乳腺异型增生,其中包含CK14~+CK5~+CK8~-αSMA~-基底样细胞,表明CK14的表达可能受到Wnt/β-catenin信号通路的调控。然而,另外一个值得关注的问题是这一过程中,Wnt配体的具体细胞学来源不明。免疫细胞被认为是一种微环境调控成员,在BC发生和进展过程中发挥重要作用。在疾病早期,组织能够分泌细胞因子/炎症因子,比如TGF-β、IFN-γ和TNF-α,来抑制肿瘤的生长。而当慢性损伤和致癌物持续存在,这种微妙的平衡将被非可控性炎症打破,转变成肿瘤发生过程中的起始事件。BC细胞可以通过mTOR信号通路或者分泌粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)来募集髓系来源抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)进入肿瘤内。MDSCs起源于骨髓和脾脏,可以分为2种主要类型:粒细胞型MDSCs(granulocytic MDSCs,PMN-MDSCs,CD45~+CD11b~+Ly6G~(hi))和单核细胞型MDSCs(monocytic M-MDSCs,CD45~+CD11b~+Ly6C~(hi))。课题组最近一篇文章表明组氨酸脱羧酶(histamine decarboxylase,Hdc)可以作为骨髓髓系偏向造血干细胞/前体细胞(myeloid-biased hematopoietic stem cell/progenitor cell,MB-HSC/HSPC)的标记物。在衰老、损伤和肿瘤发生时,MB-HSC/HSPC可以作为未成熟髓系细胞的组织学来源。表达Hdc的PMN-MDSCs在动物模型中可以通过募集Foxp3~+调节性T细胞来促进结肠癌的发生。在过去的十年内,探索基于抑制癌症相关MDSCs的个性化靶向治疗策略取得了显著进展。然而,在这些方法可以应用于临床之前,许多备受关注的争论尚需得到解决。例如,迄今为止我们对于促进BC进展的免疫细胞的具体身份尚不清楚,其中一个重要原因也是因为这些细胞的异质性。本研究中,我们通过临床病例和动物模型观察了CK14表达在晚期BC进展过程中的作用和调节机制。结果表明:相比于原位肿瘤,在BC转移灶中Hdc~+PMN-MDSCs数量显著增多并且表达高水平的Wnts来异常激活临近癌症细胞内的Wnt/β-catenin信号通路,从而提高CK14的表达。这些研究结果进一步揭示了Hdc~+PMN-MDSCs和浸润性肿瘤细胞之间的相互作用机制,并且表明通过抑制或阻断肿瘤相关Hdc~+PMN-MDSCs的靶向策略有助于乳腺癌治疗。方法:1、搜集南昌大学第二附属医院和第四附属医院的乳腺癌手术标本蜡块,制作成组织芯片,再通过常规染色和免疫组织化学染色评估和比较原发部位和转移部位肿瘤细胞表达CK14的情况;2、构建Hdc-CreER~(T2);eGFP;MMTV-PyVT雌性小鼠乳腺癌转移模型,通过免疫组化和流式细胞术分析转移组织内MDSCs的构成和数量变化;3、通过免疫组化法观察转移BC细胞内β-catenin的表达和定位情况,来初步推断Wnt/β-catenin信号通路异常激活情况;4、通过porcupine~(flox/flox)和iDTR转基因小鼠,阻断Hdc~+PMN-MDSCs来源的Wnts合成和分泌或去除所有Hdc~+免疫细胞,观察体内BC形成和进展、BC细胞表达CK14和Wnt/β-catenin活化情况。结果:1、112例未发生转移的管腔型乳腺癌中只有5例(4.5%)表达局灶CK14,而117例转移性乳腺癌病例中有33例(28.2%)出现CK14的弥漫强阳性。2、在BC转移病例内CD15~+PMN-MDSCs的数量显著增多,流式细胞术结果进一步表明在转移性BC动物模型内,Hdc~+PMN-MDSCs向肿瘤组织聚集并扩增。3、RNA-Seq和RT-PCR结果表明CK14~+BC组织内的Hdc~+PMN-MDSCs高表达多种Wnts,包括Wnt2,4,5a和7b。4、通过转基因动物消除Hdc~+免疫细胞或其来源的Wnts可以显著抑制BC转移的发生以及CK14的阳性率。结论:综上所述,我们的研究发现MDSCs,特别是Hdc~+PMN-MDSCs在转移性BC组织内聚集和扩增,通过分泌高水平的Wnts,以类似旁分泌的形式异常激活临近癌细胞内的Wnt/β-catenin信号通路,促进CK14的表达和BC的进展,为后期基于Hdc~+PMN-MDSCs靶向治疗开发提供分子理论依据。
【学位单位】：南昌大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R737.9
【部分图文】：

基于前期发现Hdc+PMN-MDSCs在CK14+肿瘤组织内增多,且两者之间具有密切的空间关系,所以课题组提出一个新的假说,认为Hdc+PMN-MDSCs可能是转移性乳腺癌组织中的一个重要的Wnts细胞来源。因此,课题组使用porcupineflox/flox和iDTR小鼠来去除Hdc+PMN-MDSCs或其来源的Wnts,进一步证实这个假说的可能性。一共构建三种转基因乳腺癌动物模型:1.Hdc-CreERT2;e GFP;MMTV-PyMT,porcupineflox/flox用于阻碍Hdc+免疫细胞分泌Wnts;2.Hdc-CreERT2;e GFP;MMTV-PyMT,DTR用于使用白喉毒素(DT)直接去除所有Hdc+免疫细胞;3.Hdc-CreERT2;eGFP;MMTV-PyMT,porcupineflox/flox;DTR转基因小鼠用于同时消除Hdc+免疫细胞及其分泌的Wnts(图1A)。研究结果表明:与对照组(Hdc-CreERT2;eGFP;MMTV-PyMT)相比,Hdc-CreERT2;eGFP;MMTV-PyMT,porcupineflox/flox小鼠转移性肿瘤的数量显著下降,但肿瘤组织内Hdc+PMN-MDSCs的数量和比例并未见显著下降(图1B)。Hdc-CreERT2;eGFP;MMTV-PyMT,DTR与Hdc-CreERT2;eGFP;MMTV-PyMT,porcupineflox/flox小鼠相比,Hdc+PMN-MDSCs的数量和比例显著下降,但转移性肿瘤的数量并无明显差别,表明在转移过程中起关键作用的可能是Hdc+PMN-MDSCs来源的Wnts。为了进一步支持这个结论,对比分析Hdc-CreERT2;e GFP;MMTV-PyMT,porcupineflox/flox;DTR转基因小鼠和其他两组之间的转移情况,发现转移数量并无明显差距(p>0.05)((图1B))。综上所述,这一部分结果支持在转移性乳腺癌发展过程中,Hdc+PMN-MDSCs是微环境中高水平Wnts的主要来源之一(图3)。4.2 Hdc~+PMN-MDSCs来源的Wnts有助于CK14 的表达

此前课题组已经发现Hdc+PMN-MDSCs与肿瘤组织CK14的不一致性表达有密切关系,且CK14+的病例预后较差。因此后续的研究继续探讨了Hdc+PMN-MDSCs来源的Wnts在推动乳腺癌转移过程中的作用。但异常激活的Wnts/β-catenin是否与CK14的表达有关系,尚无证据支持。因此,接下来课题组进一步对比分析了去除Hdc+细胞或其来源的Wnts对肿瘤细胞表达CK14的影响。结果表明与Hdc-CreERT2;e GFP;MMTV-PyMT雌性乳腺癌小鼠相比,porcupineflox/flox、DTR和porcupineflox/flox/DTR三种动物模型内表达CK14的比例显著降低,但三组之间没有显著差别,表明Hdc+PMN-MDSCs来源的Wnts是促进肿瘤细胞表达CK14的主要原因(图2)。图3.转移性乳腺癌细胞和Hdc+PMN-MDSCs之间相互作用示意图。乳腺癌细胞从原发肿瘤脱落,进入并在循环系统存活,最后在远隔器官微环境中增殖。作为肿瘤微环境中的一个重要组成成分,Hdc+PMN-MDSCs被募集至转移灶内并扩增。Hdc+PMN-MDSCs来源的Wnts以旁分泌样的方式异常激活癌症细胞的Wnt/β-catenin信号通路。β-catenin在胞浆和胞核的聚集可以上调CK14的表达,后者赋予转移细胞基底样表型,其特征为具有增强的增殖和抗凋亡能力。因此,浸润的Hdc+PMN-MDSCs对于转移灶的建立具有重要作用。未来需要进一步阐述转移细胞和骨髓内Hdc+髓系偏向造血干细胞和前体细胞之间的相互作用。

图2.Hdc+PMN-MDSCs来源的Wnts促进乳腺癌细胞表达CK14.与Wnts的水平一致,CK14阳性率在porcupineflox/flox、DTR和porcupineflox/flox/DTR转基因动物模型中显著降低(p<0.001)。5 结论
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本文编号：2863989