血管重塑性疾病模型中NONO蛋白作用及其基因调控的机制

发布时间：2020-11-02 11:19

　　 1研究背景目前,心血管疾病目前已成为发达国家最常见的致死疾病,而动脉粥样硬化是心血管疾病的主要病理原因。对于危及生命的冠状动脉粥样硬化患者,血管成形术、支架植入术、动脉粥样硬化斑块切除和旁路移植术等手术治疗仍然是不可缺少的手段。然而,机械损伤后导致的血管再狭窄是限制患者预后的最突出的病理问题。血管再狭窄是以血管中膜层增厚导致动脉新生内膜形成为特征的血管性疾病。术后血管再狭窄是位于手术扩张局部血管中膜平滑肌细胞移行至内膜并在内膜增殖,产生大量细胞外基质,造成血管内膜明显增厚,从而形成新生内膜收缩型和合成型两种表现为特征的血管重塑性疾病。因此,探讨VSMCs增殖、迁移及表型转化的影响因素和分子机制在血管新生内膜导致的血管再狭窄的防治中具有重要意义。NONO(即人p54nrb)是一个无POU结构域的八聚体结合蛋白,与SFPQ、PSPC1蛋白和长非编码RNA NEAT1共同构成DBHS蛋白家族。NONO蛋白具有RRMs、NOPS和卷曲螺旋结构域,可作为转录因子或剪切因子参与蛋白-蛋白互作和蛋白-核酸互作,在DNA损伤、RNA合成和转录调控等方面发挥重要的生物学作用。近年来研究发现,NONO还参与了乳腺癌、黑色素瘤、神经母细胞瘤、主动脉夹层及动脉粥样硬化等多种疾病。NONO作为一种多功能核蛋白,还被证实参与自身免疫性疾病的炎症因子分泌等多种病理过程。我们在前期的研究发现,过表达NONO蛋白明显抑制ApoE-/-小鼠粥样硬化斑块纤维帽的形成、抑制斑块内胶原的沉积,进而导致斑块的不稳定,促进ApoE-/-小鼠粥样硬化斑块的进展;而降低NONO蛋白的表达,通过促进胶原沉积、抑制炎症因子的表达水平,发挥稳定粥样硬化斑块的作用。然而NONO蛋白对血管新生内膜的作用及机制尚未明确,仍需进一步探索。2研究目的(1)检测NONO蛋白在人体冠状动脉组织和小鼠新生内膜组织中的表达水平;(2)检测NONO对正常幼年小鼠血管形态的影响;(3)检测NONO蛋白缺失对小鼠颈动脉结扎导致的血管新生内膜的影响;(4)探索NONO对血管新生内膜影响的潜在机制。3研究方法3.1利用CRISPR/Cas9技术获得NONO基因敲除小鼠本实验室姜虹教授利用CRISPR/Cas9技术在C57BL/6J背景小鼠中得到NONOgt/0敲基因小鼠。NONO基因位于X染色体,通过杂合母鼠NONOgt/+和野生型WT雄鼠杂交,获得NONOgt/0敲基因小鼠及其同窝对照的NONO+/0野生WT雄鼠。3.2颈动脉结扎小鼠模型的构建稳定繁殖10代后的NONO敲基因鼠及其同窝对照WT雄鼠为本实验中的所有研究用鼠。9-10周NONO基因敲除小鼠及同窝对照WT雄鼠于左侧颈动脉结扎21天后取材。3.3动物取材腹腔注射戊巴比妥钠麻醉小鼠,称量体重后固定。心尖取血后留取血清,检测总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)和高密度脂蛋白(HDL-C)水平。生理盐水充分灌流后,留取小鼠心脏、肝脏、脾脏、肾脏及两侧颈动脉,置于4%多聚甲醛或液氮中保存。颈动脉组织于甲醛固定24小时后流水冲洗,梯度酒精脱水后石蜡包埋。石蜡切片机进行5 μm连续切片。3.4组织蛋白提取采用Invent MinuteTM蛋白提取试剂盒,将液氮保存的人冠脉组织及小鼠组织放入离心管套柱中,按照1mg组织对应10μl体积的比例加入变性总蛋白提取裂解液,用研磨棒充分研磨后高速离心获得组织蛋白。采用BCA试剂盒检测蛋白浓度,加入蛋白上样缓冲液后99℃煮沸10 min使蛋白变性。3.5组织切片染色颈动脉切片分别进行苏木素-伊红(HE)染色、Verhoeff氏酒精苏木素染色、免疫组织化学染色及组织免疫荧光染色。测量血管新生内膜面积、新生内膜内平滑肌细胞、巨噬细胞和内皮细胞的含量、NONO表达水平的检测、PCNA及Ki67等增值指标表达水平的检测、SPHK1及S1PR1等迁移指标表达水平的检测。3.6小鼠原代平滑肌细胞VSMCs的提取与培养5-6周大小的NONOgt/0敲基因小鼠及其同窝对照的WT雄鼠用于提取小鼠原代平滑肌细胞。剥离、冷PBS清洗小鼠的主动脉后,采用组织贴壁法提取VSMCs,在含20%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的高糖DMEM培养基培养并按照常规方法传代。3.7人原代平滑肌细胞HASMCs的培养HASMCs购买于美国ScienCell公司,采用SMCM培养基培养并按常规方法传代。3.8 VSMCs细胞迁移的检测采用细胞划痕实验和Transwell细胞迁移实验检测有无20ng/ml的PDGF-BB刺激对WT和NONO KO的VSMCs细胞迁移的影响3.9 VSMCs细胞增殖的检测采用细胞周期检测试剂盒和CCK8检测20ng/ml的PDGF-BB对WT和NONO KO的VSMCs细胞周期及细胞增殖能力的影响。3.10逆转录荧光定量PCR(RT-PCR)组织RNA采用Qiagen的RNA提取试剂盒提取。细胞RNA采用Fastagen的RNA提取试剂盒提取。步骤均参照试剂盒说明书。Nanodrop检测RNA浓度后,采用Takara反转录试剂盒获得cDNA,SYBR及特异性引物进行实时定量PCR,检测NONO、PCNA、p21、SPHK1、S1PR1、α-SMA、CNN1、SM22α的 mRNA 表达水平。3.11细胞免疫荧光细胞免疫荧光检测20ng/ml的PDGF-BB对WT和NONO KO的VSMCs细胞诱导的Erkl/2表达水平及细胞核转位的影响。3.12 蛋白质印记法(Western blot,WB)收集人冠脉组织及小鼠动脉组织和细胞,提取蛋白,检测组织NONO及VSMCs细胞内 NONO、PCNA、p21、α-SMA、SM22α、p-MEK1、t-MEK1、p-Erk1/2、t-Erk1/2的蛋白表达水平,以GAPDH作为内参。3.13蛋白质免疫共沉淀(Co-IP)适用于IP实验的RIPA及PMSF裂解VSMCs细胞蛋白,检测20ng/ml的PDGF-BB刺激细胞后NONO与Erk1/2相互结合的情况。3.14人冠状动脉组织的获取冠状动脉组织来自山东大学齐鲁医院心血管实验室。从器官供者的移植心脏获取冠状动脉,并在手术室内以最短的缺血时间(15分钟)进行处理。由经验丰富的心脏外科医生根据器官供者冠状动脉粥样硬化的不同程度,将动脉段划分为健康或病变。研究方案由山东大学齐鲁医院科研伦理委员会批准科研伦理号:KYLL-2016-333。3.15统计分析实验数据均以均数±标准误表示。应用SPSS 19和Graphpad Prism 5软件进行统计学分析及作图。对于符合正态分布的两组样本间比较采用独立样本t检验,多样本间比较采用单因素方差分析One-way ANOVA检验,其下的各组间事后检验采用Dunnett's多重检验;对于不符合正态分布的样本比较采用非参数检验。双侧P0.05认为具有统计学差异。4研究结果4.1 NONO在人体狭窄的冠脉组织和WT小鼠颈动脉结扎组织中的表达增加人体粥样硬化斑块导致的狭窄冠脉组织中NONO的RNA水平及蛋白水平均显著高于正常冠脉组织中NONO的表达水平(P0.05);在WT小鼠颈动脉结扎后内膜新生的动脉组织NONO的RNA水平及蛋白水平均明显高于对侧正常的小鼠颈动脉组织(P0.05)。4.2 NONO蛋白主要分布在平滑肌细胞内人粥样硬化斑块导致的狭窄冠脉组织及WT小鼠颈动脉结扎导致血管新生内膜的组织免疫荧光染色显示,NONO与SM22α的荧光共定位最多,推测在狭窄的冠脉及内膜新生组织中,NONO蛋白主要分布在平滑肌细胞内。4.3 NONO基因敲除小鼠及其同窝对照小鼠的基本情况通过CRISPR/Cas9技术在C57BL/6J背景小鼠中得到NONOgt/0敲基因小鼠。NONOgt/0雄鼠的体重、出生率和存活率严重低于同窝对照的WT雄鼠,此外,与WT小鼠相比,NONO KO小鼠的颅面形态也发生了变化。在NONOgt/0敲基因小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、脑及主动脉血管等组织中均不存在NONO蛋白的表达。9-10周龄的NONO基因敲除小鼠及其同窝对照小鼠的血清TC、TG、LDL-C及HDL-C表达水平无统计学差异,提示NONO对小鼠的血脂水平无影响。但NONO基因敲除小鼠的体重明显低于同窝对照的WT小鼠(P0.05),提示NONO对小鼠的生长发育有影响。4.4 NONO蛋白不参与小鼠血管形态的维持NONO蛋白缺失会导致小鼠体重减轻,但对血管形态的维持无影响。分别取4周、5周、6周龄NONOgt/0敲基因小鼠及其同窝对照WT雄鼠的左侧颈动脉HE染色,显示2组小鼠血管内径及血管中膜厚度均无显著差异。此外,NONO蛋白缺失会影响DBHS蛋白家族PSPC1的表达,对SFPQ的表达量无影响。4.5 NONO蛋白缺失抑制小鼠结扎血管的内膜新生Verhoeff染色显示NONO蛋白缺失明显抑制了小鼠结扎颈动脉血管的内膜新生(P0.05)。4.6 NONO蛋白缺失抑制血管平滑肌细胞的增殖组织免疫荧光染色及组织化学染色显示,NONO蛋白缺失通过抑制Ki67及PCNA的表达明显抑制血管新生内膜病理过程中的细胞增殖作用(P0.05)。体外培养原代VSMCs的实验结果进一步显示,NONO蛋白缺失明显抑制PDGF-BB刺激下细胞周期中的合成期(S期)、抑制细胞增殖(P0.05),同时WB及PCR结果显示NONO KO能显著抑制PDGF-BB刺激下的VSMCs中PCNA表达量(P0.05),显著增加p21的表达量(P0.05)。4.7 NONO蛋白缺失抑制血管平滑肌细胞的迁移和表型转换组织化学染色显示,NONO蛋白缺失通过抑制SPHK1及S1PR1的表达明显抑制血管新生内膜病理过程中的细胞迁移作用(P0.05)。体外培养原代VSMCs的实验结果进一步显示,NONO蛋白缺失明显抑制细胞迁移(P0.05),PCR结果显示NONO KO明显抑制PDGF-BB刺激下的VSMCs中SPHK1及S1PR1的表达量显著下降(P0.05)。同时WB及PCR结果显示,PDGF-BB刺激的NONO KO的VSMCs中平滑肌收缩表型α-SMA、CNN1、SM22α的表达水平显著增加(P0.05)。4.8 NONO蛋白与Erk1/2相互作用共同调控血管新生内膜中VSMCs的作用细胞免疫荧光染色显示,在PDGF-BB的刺激下,WT VSMCs中Erk1/2发生明显核转位,而NONO KO能够显著抑制Erk的核转位。免疫共沉淀检测发现NONO蛋白能够与Erk1/2蛋白相互结合。WB结果进一步显示,NONO KO降低PDGF-BB刺激下Erk1/2的磷酸化表达水平。5结论(1)血管新生内膜的NONO蛋白主要存在于平滑肌细胞中,NONO蛋白缺失明显抑制血管重塑的病理过程;(2)NONO蛋白缺失对血管的完整性无影响;(3)NONO蛋白缺失通过抑制VSMCs的增殖、迁移、细胞表型转化,抑制新生内膜,并通过抑制Erk1/2的磷酸化水平发挥作用。1研究背景腹主动脉瘤(AAA)是一种慢性退行性血管疾病,病人常突发动脉瘤破裂、猝死等严重并发症。目前,世界上每年至少20万人死于AAA,而其中瘤体破裂出血占AAA患者死因的90%。对于AAA瘤体巨大的患者而言,外科手术进行血管修复是目前唯一可行的办法;而对于瘤体较小的患者,仍缺乏行之有效的药物治疗或手术替代疗法。AAA的病理过程包括细胞外基质(ECM)受损及炎性反应。血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)是肾素-血管紧张素系统的重要调控因子,促进AAA的基质降解、慢性炎症浸润及血管重塑。一方面,转化生长因子β(TGF-β)信号转导通路的失活通过抑制ECM合成及促进基质降解,促进AAA的病理性发展。而TGF-β1通过促进胶原合成的关键限速酶辅氨酰-4-羟化酶α1(P4Hα1)的合成促进胶原的合成。另一方面,AAA组织炎性细胞的浸润增加基质金属蛋白酶(MMPs)活性导致ECM的降解,进而加剧AAA的发展。本实验室首次发现肿瘤坏死因子α(TNF-α)通过ASK-JNK-NONO信号通路直接抑制P4Hα1的活性,抑制胶原合成;并首次提出NONO蛋白参与动脉粥样硬化(AS)的病理过程,同时通过与NF-κB p65蛋白相互作用调控AS的炎症反应。NONO(即人p54nrb)作为核蛋白,参与DNA损伤修复、RNA转运及翻译调控等基因调控过程,是一个多功能的高度保守蛋白。NONO蛋白作为cAMP信号通路的重要组成部分,调控cAMP下游TNF-α及白介素6(IL-6)的表达。一方面,NONO下调人主动脉平滑肌细胞(HASMCs)及小鼠AS斑块P4Hα1的表达,抑制ECM合成;另一方面,NONO与NF-κB p65相互作用加剧AS的炎症反应并参与不稳定斑块的形成。这两方面的作用均表明,NONO可能参与AAA的病理过程,而目前尚无相关研究。由此,我们推测通过NONO蛋白的敲减可能会通过增加胶原沉积及抑制炎症反应发挥抑制AAA病理过程的作用。2研究目的(1)探索NONO在AAA中的分布及作用;(2)观察NONO敲减后对AAA病理过程的影响;(3)探索NONO敲减对AAA的作用机制。3研究方法3.1分离并培养小鼠原代血管平滑肌细胞(VSMCs)将6周龄ApoE-/-雄性小鼠主动脉剥离后,剥去动脉外膜及内膜,冷PBS加1%青链霉素清洗三遍后,将血管用无菌维纳斯剪成长度为1mm左右的动脉组织,在含20%胎牛血清(FBS)的高糖培养基(DMEM)中贴壁培养,7天后换液。第3～9代的小鼠原代VSMCs用于本实验研究。3.2小干扰RNA(siRNA)及干扰慢病毒的制备无义序列的小干扰RNA(si-NC)作为阴性对照,NONO干扰序列的小干扰RNA(si-NONO)如下:CCCACCAACAACTGAACGTTTCTCGAGAAACGTTCA GTTGTTGGTGGG。利用含有 pHelper 1.0 和 pHelper 2.0 的 siRNA 表达载体,在293T细胞中构建慢病毒(LV)。在293T细胞中转染si-RNA48小时后,收集病毒上清并将其通过0.45孔径的醋酸纤维素针式过滤器过滤。通过对293T细胞GFP阳性细胞进行荧光激活细胞分选分析,检测病毒载体的滴度。按照病毒感染复数(MOI)=100的比例,利用NONO干扰慢病毒转染VSMCs。病毒转染3天后收集细胞蛋白检测转染效率或用于不同实验研究。3.3动物造模8周龄ApoE-/-雄性小鼠购于北京维通利华动物实验中心,遵循山东大学齐鲁医院伦理委员会要求饲养小鼠并造模。在22℃室温12h白天/12h黑夜齐鲁医院心血管实验室动物中心高脂(0.25%胆固醇加15%可可脂)喂养小鼠。本实验共包括三个部分:第一部分:20只8周龄ApoE-/-雄性小鼠随机分为对照组(n=10)和AAA组(n=10)。高脂喂养4周后对照组小鼠继续高脂喂养4周获得对照组模型;AAA组小鼠通过高脂喂养4周后皮下埋入渗透泵(Alzet model 2004)泵注Ang Ⅱ(1.44mg/kg/d)4周获得小鼠AAA组。用以检测小鼠AAA组织中NONO蛋白的表达量。第二部分:20只8周龄ApoE-/-雄性小鼠随机分为以下四组。无尾静脉注射慢病毒且无Ang Ⅱ泵注高脂喂养4周后取材(n=5);高脂喂养初期尾静脉注射sh-NC慢病毒(2 × 107TU/只)并高脂喂养4周后取材(n=5);高脂喂养初期尾静脉注射sh-NC慢病毒(2 × 107 TU/只)并高脂喂养4周后皮下埋入渗透泵泵注Ang Ⅱ(1.44mg/kg/d)2周后取材(n=5);高脂喂养初期尾静脉注射sh-NC慢病毒(2 × 107 TU/只)并高脂喂养4周后皮下埋入渗透泵泵注Ang Ⅱ(1.44mg/kg/d)4周后取材(n=5)时取材,均用于检测GFP荧光强度,明确转染效率。第三部分:100只8周龄ApoE-/-雄性小鼠随机分为对照组(n=25)、Ang Ⅱ组(NT 组,n=25)、Ang Ⅱ+sh-NC 组(sh-NC 组,n=25)、以及 Ang Ⅱ+sh-NONO组(sh-NONO组,n=25)。其中,对照组小鼠无尾静脉注射慢病毒且无Ang Ⅱ泵注高脂喂养8周后取材;NT组于高脂喂养初期尾静脉注射0.9%生理盐水4周后皮下埋入渗透泵泵注Ang Ⅱ(1.44mg/kg/d)4周后取材,sh-NC组于高脂喂养初期尾静脉注射sh-NC(2 × 107TU/只)的阴性对照慢病毒4周后皮下埋入渗透泵泵注Ang Ⅱ(1.44mg/kg/d)4周后取材,sh-]NO]NO组于高脂喂养初期尾静脉注射sh-NONO(2 × 107 TU/只)的干扰慢病毒4周后皮下埋入渗透泵泵注Ang Ⅱ(1.44mg/kg/d)4 周后取材。3.4小鼠体重及血脂水平的检测分别于实验前及试验结束时称量ApoE-/-小鼠体重。左室心尖部抽血留取血清,分别检测总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)和高密度脂蛋白(HDL-C)的血脂水平。3.5血压测量分别于实验前及试验结束时,通过尾静脉测量ApoE-/-小鼠血压。每只小鼠血压测量三次取平均值。3.6AAA测量留取小鼠全长主动脉,置于4%多聚甲醛过夜保存。大体显微镜下剥离主动脉外膜多余的结缔组织及脂肪组织,拍照记录。通过Image-Pro Plus 6.0测量动脉最大直径以测量瘤体大小。AAA是以主动脉直径增加150%,或任何瘤体内出血(含直径增加仅110%)。AAA的严重度分级包括:None,无动脉瘤;Ⅰ型,管腔扩张但无腔内血栓形成;Ⅱ型,管腔扩张伴腔内血栓形成;Ⅲ型,明显的管腔扩张但无腔内血栓形成;Ⅳ型多发动脉瘤伴血栓,部分动脉瘤重叠。两名研究者进行统计分析。3.7主动脉组化分析石蜡包埋主动脉弓至肾动脉的组织,在主动脉直径最大部分利用石蜡切片机进行5μm连续切片用于组织化学染色。苏木素-伊红染色(HE染色)用于评估AAA形态;Verhoeff染色用于观察AAA弹力纤维的完整性:Masson染色及天狼猩红染色用于检测AAA胶原含量;组化染色分别检测巨噬细胞、平滑肌细胞、胶原Ⅰ(CI)、胶原Ⅲ(CⅢ)、P4Hα1、基质金属蛋白酶2(MMP2)、基质金属蛋白酶9(MMP9)、白介素1β(IL-1β)、单核细胞趋化因子1(MCP-1)、白介素6(IL-6)及TNF-α的表达量,IgG作为组化染色的阴性对照,所有组化染色结果利用Image J软件统计分析。3.8细胞培养含20%胎牛血清的高糖DMEM用于培养原代小鼠VSMCs。首先,1 × 10-7 mol/L的Ang Ⅱ用于刺激VSMCs模拟AAA,收集细胞蛋白检测NONO表达量;然后,通过MOI=100的病毒复染指数转染VSMCs分别转染sh-NC及sh-NONO病毒,三天后加入1 × 10-7 mol/L的Ang Ⅱ刺激VSMCs进行体外实验研究。所有实验结果至少重复三次。3.9 Western Blot 检测ApoE-/-雄性小鼠主动脉或VSMCs提取组织蛋白或细胞蛋白用于Western blot实验。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、5%脱脂牛奶封闭非特异性抗原、孵育对应的一抗及二抗、辣根过氧化物酶发光显影等操作,检测NONO、CⅠ、CⅢ、P4Hαl、MMP2、MMP9、IL-lβ、MCP-1、TNF-α 磷酸化NF-κB p65(p-p65)及总NF-κB p65(t-p65)的蛋白表达量,GAPDH作为western blot的内参以证实蛋白上样量一致。3.10细胞免疫共沉淀(co-IP)将VSMCs种于150 mm2培养皿中,在细胞密度达80%-90%后血清饥饿细胞24h,加入1 × 10-7 mol/L的Ang Ⅱ刺激1h,提取蛋白进行免疫共沉淀。分别用NONO一抗或NF-κB p65一抗孵育的蛋白A/G琼脂糖珠拉取NONO蛋白及NF-κB p65蛋白,IgG为阴性对照。通过western blot技术检测结合蛋白。3.11细胞免疫荧光检测1 × 10-7 mol/L的Ang Ⅱ刺激80%密度的VSMCs细胞爬片1h后,通过甲醛固定、Triton破膜、5%BSA封闭非特异性抗原、孵育NONO及NF-κB p65一抗、相对应的荧光二抗、DAPI染色及荧光共聚焦显影,检测NONO及NF-κB p65的共定位。3.12数据统计利用SPSS v19.0进行数据分析。统计数据均以均数±标准误表示。通过独立样本t检验进行两两比较;单因素方差分析用于满足方差齐性假设的多组比较;非参数齐性检测用于多因素比较。卡普兰-迈耶曲线(生存率曲线)用于小鼠生存状态的统计分析。P0.05表示差异有统计学意义。4研究结果4.1 NONO蛋白在ApoE--小鼠AAA组织及Ang Ⅱ刺激的VSMCs中的表达与正常主动脉组织相比,ApoE-/-小鼠AAA组织中NONO蛋白的表达量明显增加(P0.05);与正常VSMCs相比,Ang Ⅱ刺激后VSMCs中NONO蛋白的表达量明显增加(P0.05)。小鼠AAA组织荧光共定位染色显示,NONO蛋白在巨噬细胞、血管平滑肌细胞及内皮细胞中均有表达,且无明显的统计学差异。4.2慢病毒在体内及体外的转染效率检测分别于ApoE-/-小鼠尾静脉注射sh-NC慢病毒4周、6周及8周时,通过检测小鼠主动脉GFP荧光强度明确小鼠体内慢病毒的转染效率,结果显示三个不同的时间节点取材获得的小鼠主动脉均观察到GFP的绿色荧光。Sh-NONO慢病毒转染小鼠后,AAA组织中NONO蛋白表达量下调约50%(P0.01)。Sh-NONO慢病毒转染VSMCs后,小鼠原代平滑肌细胞中NONO蛋白表达量下调超过50%(P0.01)。4.3四组ApoE-/-小鼠的血脂及血压水平本实验第三部分的四组ApoE-/-小鼠的血脂水平均无明显差异。皮下泵注AngⅡ的小鼠收缩压水平明显升高,而NONO蛋白敲减组AAA造模小鼠的收缩压较其他AAA造模小鼠的收缩压无明显差异。4.4降低NONO蛋白的表达明显下调Ang Ⅱ导致的ApoE-/-小鼠AAA的发生率第三部分实验结果显示,对照组小鼠无AAA的发生,而Ang Ⅱ导致的ApoE-/-小鼠AAA的发生率在NT组、sh-NC组及sh-NONO组分别为80%(P0.05)、84%(P0.05)及48%(P0.05)。根据AAA的严重度分级显示,NT组及sh-NC组中Ⅲ型及Ⅳ型AAA 比例更高,而sh-NONO组中Ⅰ型及Ⅱ型AAA的比例较高。因此,降低NONO蛋白的表达量能够明显降低AAA的发生发展。此外,腹主动脉的最大直径在Ang Ⅱ刺激ApoE-/-小鼠中明显升高(P0.05),sh-NONO组腹主动脉的最大直径显著低于NT组(P0.05)及sh-NC组(P0.05),NT组及sh-NC组无明显统计学差异。生存曲线显示,Ang Ⅱ明显降低小鼠的存活率。4.5降低NONO蛋白的表达对AAA组织及形态的影响HE及Verhoeff染色显示,Ang Ⅱ刺激ApoE-/-、鼠导致AAA的病理过程中出现主动脉外膜病理性膨大、中膜结构损坏及弹力纤维断裂等。慢病毒敲减NONO蛋白后,上述病理性改变较NT组及sh-NC组明显减轻;而NT组及sh-NC组的血管病理性形态改变无明显差异。此外,sh-NONO组小鼠AAA组织中动脉壁胶原含量、平滑肌细胞含量明显升高(P0.05),巨噬细胞含量明显下降(P0.01);而NT组及sh-NC组的血管中的胶原含量及细胞组成成分的改变无明显差异。4.6降低NONO蛋白的表达对胶原沉积和胶原降解的影响免疫组化及天狼猩红染色结果显示,相比NT组及sh-NC组的AAA组织,敲减 NONO 蛋白能够显著增加 P4Hα1(P0.01)、CI(P0.01)和 CⅢ(P0.01)的表达量及天狼猩红阳性率(P0.01),同时显著降低MMP2(P0.01)、MMP9(P0.01)的表达量;而上述指标在NT组及sh-NC组的AAA组织无明显差异。Ang Ⅱ刺激VSMCs 24h提取细胞蛋白的Western Blot结果显示,相比NT组及sh-NC组的VSMCs,敲减NONO蛋白能够显著增加CI(P0.01)、CⅢ(P0.01)及P4Hα1(P0.01)的蛋白表达量,同时显著降低MMP2(P0.01)、MMP9(P0.05)的表达量。4.7降低NONO蛋白的表达对炎性因子浸润的影响免疫组化染色结果显示,相比NT组及sh-NC组的AAA组织,敲减NONO蛋白能够显著降低 IL-1β(P0.01)、MCP-1(P0.01)、IL-6(P0.01)和 TNF-α(P0.01)的表达;而上述指标在NT组及sh-NC组的AAA组织无明显差异。Ang Ⅱ刺激VSMCs 24h提取细胞蛋白的Western Blot结果显示,相比NT组及sh-NC组的VSMCs,敲减NONO蛋白能够显著抑制IL-1β(P0.01)、MCP-1(P0.01)和TNF-α(P0.01)的表达。4.8降低NONO蛋白的表达对NF-κB p65核转位及磷酸化水平的影响转录因子NF-κB p65作为AS的重要调控因子,参与调控炎症因子IL-1β、IL-6及MCP-1的表达水平。通过细胞免疫共沉淀实验,发现NONO蛋白与NF-κB p65在Ang Ⅱ刺激后能够相互结合。荧光染色结果显示,NONO蛋白敲减能够显著抑制Ang Ⅱ刺激导致的NF-κB p65的核转位,IgG为阴性对照。同时,NONO蛋白敲减能够显著抑制Ang Ⅱ刺激导致的NF-κB p65的磷酸化水平(P0.01)。5结论(1)通过慢病毒敲减ApoE-/-小鼠NONO蛋白的表达量,可通过增加胶原沉积、抑制炎症反应,抑制Ang Ⅱ导致的小鼠AAA的形成;(2)敲减NONO蛋白可能通过抑制NF-κB p65的磷酸化水平发挥对AAA的有益作用。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R543
【部分图文】：

?ｉ???ＣＣＫ８、细胞阔期检测、?ｑＲＴ－ＰＣ’Ｒ检测：?Ｗｅｓｔｅｒｎ?Ｂｌｏｔ检测：?信号通路的检测：??Ｔｒａｕｓｗｅｌｌ小室、细胞到痕实验、ＮＯＮＯ、ＰＳＰＣ１、ＳＦＰＱ、?Ｎ〇Ｎ〇、ｐＳＰｎ、ＳＦＰｑ、ｐＣＮＡ、?ＮＯＮＯ?＋?Ｅｒｋｌ，＿＿２的??｜?ＩＦ：?ＮＯＮＯ＋Ｅｒｉｃｌ／２?ＰＣＮＡ－?ｐ２Ｋ?ＳＭ２２ａ．?ｐ：Ｋ?Ｓ＼Ｉ：２ａ，?ａ－ＳＭＡ，?ｐ－ＭＥＫｌ、｜?Ｉ?蛋白互作—??ａ－ＳＭＡ???ｔ－ＭＥＫｌ、ｐ－Ｅｉｋｌ，２、ｔ－Ｅｉｋｌ／２??图２．体外实验流程图??ＶＳＭＣ：血管平滑肌细胞；ＫＯ：敲除。??５１??

ＴＣｏｎｔｒｏｌＷＴＬＪｇａｔｉｏｎ?ＩｇＧ?Ｅ?Ｆ?６??＿?！Ｉｉｊ?｜ｕ??ｈ?§ｕ?ｉ〇??Ｈ?ＨＡＳＭＣ??ＰＤＧＦ－昍＝ＺＩＺ?Ｓ１５１?．￣！！￣?Ｊｉｓ，?．．．??ＮＯＮＯ?－?－－?５４ＫＤａ??ＧＡＰＯＨ???３７ＫＤａ?Ｉ卜?ｌ卜??■■■?ｐ〇ｃ，ｂｂ＾ｃ?ｍｍ?Ｂ?ｍｍＭ??ＮＯＮＯ?５４?ＫＤａ?°?０?０?ＨＡＳＭＣ?ＨＡＳＭＣ＊ＰＤＧＦ－８Ｂ?ｗｔ?ｓｍｃ?ｗｔ?ｓｍｃ＊ｐｄｇｆ－８ｂ??ＧＡＰＤＨ?－?—?－３７?ＫＤａ??图４．?ＮＯＮＯ蛋白主要分布在平滑肌细胞内??Ａ：免疫荧光检测ＮＯＮＯ和ＳＭ２２ａ在人正常和狭窄冠脉组织的表达，图中黄色??箭头标不ＮＯＮＯ和ＳＭ２２ａ的共定位，Ｌ标不血营管ｆｅ，标尺＝５０?｜ｊｍ；?Ｂ：免疫??荧光检测ＮＯＮＯ和ＳＭ２２ａ仵人狭窄冠脉组织的表达，阁屮黄色箭头杬示ＮＯＮＯ??和ＳＭ２２ａ的共定位，Ｌ、Ｍ、Ｉ分别标示血管管腔、中膜、内膜，标尺＝５０?ｐｍ；??Ｃ：免疫荧光检测ＮＯＮＯ和ＣＤ６８在人狭窄冠脉姐织的表达，阁屮黄色箭头标示??ＮＯＮＯ和ＣＤ６８的共定位，Ｌ标示血管管腔，标尺＝５０｜＿ｉｍ；?Ｄ：免疫荧光检测??ＮＯＮＯ和ＳＭ２２ａ、ＣＤ３１、ＣＤ６８在小鼠ｉＨ常和结扎后的颈动脉屮的ＪＩ：表达，图??中黄色箭头标示ＮＯＮＯ和ＳＭ２２ａ?（上）、ＮＯＮＯ和ＣＤ３１?（屮）、ＮＯＮＯ和ＣＤ６８??（下）的共定位，标尺＝Ｅ：小鼠正常和结扎后的颈动脉ＮＯＮＯ和ＳＭ２２ａ??的共定位分析，Ｎ＝５／组；Ｆ：小鼠正常和结扎后的颈动脉ＮＯＮＯ和ＣＤ３１的共定??位分析，Ｎ＝５／组；Ｇ：小鼠正常和结扎后的颈动脉ＮＯＮＯ和ＣＤ６８的共定位分

慢病毒ＮＯＮＯ组；ＡＡＡ：股丨？：动脉瘤；ＷＢ：蛋白印迹；ｍｅ：免疫组化染色。??ＡｐｏＥ?背苽?ＷＴＶＳＭＣｓ??Ｎｏ?ｔｒｅａｔｍｅｎｔ＾１１?Ｓｈ－ＮＣ组?Ｓｌｉ－ＮＯＮＯ组??？?ＷＢ：?Ｃｏｌｌａｇｅｎ?Ｉ?％?Ｃｏｌｌａｇｅｎ?ＵＫ?Ｐ４ＨａＫ?ＭＭＰ２＾?ＭＭＰ９＞??ＩＬ－ｉｐ＞?ＭＣＰ－Ｋ?ＴＮＦ－ａｖ?ｐ－ＮＦ－ＫＢ?ｐ６５．?ｔ－ＮＦ－ＫＢ?ｐ６５??？?Ｃｏ－ＩＰ：?ＮＯＮＯ＋ｔ－ＮＦ－ＫＢ?ｐ６５??？免疫荧光染色：ＮＯＮＯ＋ｔ－ＮＦ－ＫＢ?ｐ６５??图２．体外实验流程图??ＶＳＭＣ：血管平滑肌细胞；Ｎｏ?ｔｒｅａｔｍｅｎｔ组：生理盐水组；Ｓｈ－ＮＣ组：干扰慢病毒阴性对照；??Ｓｈ－ＮＯＮＯ组：干扰慢病毒ＮＯＮＯ组；ＷＢ：蛋白印迹；Ｃｏ－ＩＰ：免疫共沉淀。??１０７??
【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 Ning Shi;Shi-You Chen;;Mechanisms simultaneously regulate smooth muscle proliferation and differentiation[J];The Journal of Biomedical Research;2014年01期

本文编号：2866982