MDCK细胞基质与鸡胚基质培养对流感病毒及其疫苗影响的研究

发布时间：2020-11-04 14:02

　　 【目的】建立纯化细胞基质流感疫苗的方法,并从分子水平、蛋白水平及糖基化水平研究MDCK细胞基质与鸡胚基质制备的H1N1病毒HA蛋白生物学特性的差异,系统性评价这些生物学特性的变化对于病毒的免疫原性和疫苗的效果的影响。【方法】采用MDCK悬浮细胞平台技术,分别培养流感病毒H1N1、H3N2、BV及BY,通过多步纯化获得较纯的抗原,制备方式包括低速离心、分子筛纯化、离子交换纯化、广谱核酸酶添加,制备成细胞基质单价H1N1疫苗及细胞基质四价流感疫苗,同时与鸡胚基质制备的单价H1N1疫苗及四价疫苗进行比较研究。进一步处理单价H1N1疫苗,将其去糖基化,制备成去糖基化的细胞基质和鸡胚基质单价H1N1疫苗。通过动物试验比较单价和四价疫苗之间免疫原性差异并对其免疫效果进行评价。同时,通过核酸测序比较两种基质培养的H1N1病毒HA核酸序列的差异;通过质谱检测比较HA蛋白氨基酸序列、糖基化位点和糖基化修饰的差异;通过动物试验比较接种后小鼠血清中细胞因子及脾脏细胞中免疫细胞分化的差异,分析上述生物学特性的差异对疫苗免疫原性的影响。在动物试验中本文还系统性比较了两种疫苗对于不同类型免疫反应的诱导能力,及剂量对于疫苗有效性的影响。【结果】纯化结果显示,该纯化策略适用于四种病毒,病毒液中的宿主蛋白去除率均高于90%,宿主DNA去除率均高于90%,血凝素回收率均高于40%,在一系列纯化后添加广谱核酸酶能进一步去除残留DNA。在生物学特性试验中,两种基质培养的流感病毒HA核酸序列一致;HA蛋白氨基酸组成与理论序列覆盖率均高于94%;鸡胚基质培养的H1N1病毒HA蛋白在N27、N39、N103、N178、N303、N497处均发现糖基化,细胞基质制备的H1N1病毒HA蛋白在N27、N39、N178、N292、N497处有糖基化,细胞基质培养的病毒在N103和N303处糖基化位点的缺失是由脱酰胺作用造成的;经过糖型分析发现,细胞基质培养的H1N1病毒HA蛋白的糖基化修饰更加复杂,多天线糖基化修饰所占比例更高,鸡胚基质培养的H1N1病毒HA蛋白中糖基修饰比较单一,主要是高甘露糖及去岩藻糖基聚糖。细胞免疫及天然免疫相关多细胞因子组动物试验结果显示,小鼠在接种细胞基质制备的流感疫苗后的6小时内,血清中MCP-1、IP-10及IL-6浓度显著升高,说明小鼠的天然免疫反应被激活,而鸡胚基质流感疫苗和去糖基化流感疫苗所引起的细胞因子变化无显著性差异,说明HA蛋白上的糖基化是诱导天然免疫的因素之一;体液免疫相关多因子组动物试验结果显示,各组小鼠在接种10天后,血清中的IL-4、IL-5及IL-10浓度无显著性差异,说明不同基质的流感疫苗及去糖基化流感疫苗在诱导体液免疫能力上差异较小;胞内细胞因子染色试验结果显示不同疫苗组之间B细胞所占比例无显著性差异,进一步说明不同基质流感疫苗在诱导体液免疫能力上差异不大,而细胞基质流感疫苗能更有效的激活CD8+T细胞的分化,且分泌TNF-α、IFN-γ及IL-2的T细胞所占比例显著高于其鸡胚基质疫苗和去糖基化流感疫苗组,说明细胞基质流感疫苗可诱导更强的细胞免疫反应,同时也说明糖基化的去除显著降低了疫苗的免疫原性及免疫效果;在体外中和试验中,小鼠在接种第二针疫苗后血清中具有中和活性的抗体显著增加,且细胞基质疫苗组小鼠的血清中和效价显著高于鸡胚基质疫苗和去糖基化疫苗组,但是在血凝抑制试验中,发现鸡胚基质疫苗组的血清保护能力略高于细胞基质流感疫苗组,这两项试验结果的矛盾可能与病毒的培养基质有关;在细胞基质流感疫苗组中比较了低、较低、中、高四个不同剂量,结果显示高剂量组诱导天然免疫、细胞免疫及体液免疫的能力显著强于中、低剂量组,说明增加剂量对细胞基质流感疫苗所产生的免疫保护结果有显著影响。【结论】本课题摸索了一套可应用于工业生产的细胞基质流感疫苗纯化策略,该方法可有效去除宿主蛋白和DNA,且在不添加广谱核酸酶的条件下宿主DNA残留量达到欧洲药典中核酸残留质量标准。在HA蛋白生物学特性的研究中发现其糖基化位点与糖基化修饰会受到培养基质的影响,在细胞基质培养的H1N1病毒中发现了一个独特的糖基化位点N292,但是该位点处于HA蛋白茎部不属于抗原表位区域,且保守性评分较低,说明并可能未处在受体结合区域,所以对于病毒的免疫原性影响仍需进一步确定;同时还发现不同基质培养的H1N1病毒HA上处于受体结合区域的几个糖基化位点的糖基化修饰存在显著差异,因HA蛋白球状头部的糖蛋白在病毒侵染细胞时起关键的识别作用,所以这些位置的糖基化差异有可能导致病毒免疫原性的变化,这说明HA蛋白上的多天线糖基化修饰和更加复杂的糖基化修饰可能是导致流感病毒免疫原性差异的重要原因。同时本研究还发现细胞基质培养的流感病毒在N103和N303处糖基化缺失是由于脱酰胺作用造成,脱酰胺作用能使蛋白质的局部疏水性发生变化,影响蛋白质的空间结构,这与培养基质的pH值、离子种类、离子强度密切相关,说明哺乳动物细胞的细胞内环境可能是造成病毒糖蛋白趋向保守的主要原因。在动物试验中发现糖基化的存在对于疫苗诱导天然免疫和细胞免疫有显著影响,说明HA蛋白的糖基化在诱导机体的天然免疫和细胞免疫时起到一定作用,这可能是因为细胞基质中流感病毒HA糖基化修饰使得病毒更容易被天然免疫和细胞免疫相关细胞识别。体液相关细胞因子的分泌情况与B细胞分化情况说明不同基质制备的流感疫苗的诱导体液免疫能力较为一致,但是动物试验中的体外中和试验结果与血凝抑制试验结果存在矛盾,产生这一现象的原因可能是由于体外中和试验中所用的细胞就是培养流感病毒的MDCK细胞,所以小鼠血清中抗体特异性更强,导致血清的中和效价更高,而血凝抑制所用的材料为鸡血红细胞,在结合鸡胚基质培养的流感病毒时能力更强,导致血凝实验中鸡胚基质疫苗组结果更好,同时上述两项试验结果也说明在检定两种基质流感疫苗时应区分别建立特异性检定方法才能获得更准确的检定结果。
【学位单位】：武汉生物制品研究所
【学位级别】：博士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R392-33
【部分图文】：

武汉生物制品研究所2020届博士研究生毕业论文4三个主要部分组成。包膜蛋白由三种跨膜蛋白修饰：HA、NA和基质蛋白2（MatrixProtein2,M2），其中HA和NA均为囊膜糖蛋白，是体液免疫反应所针对的关键抗原，M2蛋白则起到离子通道作用，在病毒包膜外的HA和NA具有顶端分选信号[4]，并利离子通道进行细胞表面运输和顶端分选，HA蛋白作为流感病毒上一种极为重要的包膜蛋白，是一种突出于病毒表面的蛋白质，负责病毒与宿主细胞的附着、病毒的内化以及病毒衣壳与细胞核内体膜的融合[5]，HA蛋白的结构可分为球状头部（HA1）和跨膜的茎部（HA2），即使在同一亚型中流感病毒的HA1部分也会产生较大变异，茎部则相对保守；基质蛋白则处于中间层，主要是基质蛋白1（MatrixProtein1,M1）构建起整个病毒的骨架；核心由聚合酶碱性蛋白1和2（PolymeraseBasicProtein1，PB1;PolymeraseBasicProtein2,PB2）、核蛋白（Nucleoprotein）和负链病毒RNA组成最内层螺旋状病毒核糖核衣壳蛋白（vRNP）。除此之外，病毒颗粒中还含有非结构蛋白2（NonstructuralProtein2，NS2）等蛋白。病毒的结构如图1所示。图1.1流感病毒结构示意图Fig1.1Influenzavirusstructure流感疫苗的变异主要由抗原漂移（AntigenicDrift）及抗原转换（AntigenicShift）引起。抗原漂移是指病毒核苷酸位点的突变而导致的氨基酸的改变，某些关键位点的氨基酸变化则会导致病毒的抗原性发生变化。这是因为流感病毒属于RNA病毒，而RNA病毒的聚合酶的校正阅读能力是缺失的，所以在病毒复制过

武汉生物制品研究所2020届博士研究生毕业论文7图1.2中国2017.06至2019.09流感发病人数统计图Fig1.2NumberofinfluenzacasesinChinafromJune2017toSeptember2019大规模的流感流行均是由甲型流感病毒引起的，季节性流感则主要由甲型和乙型两种病毒引起。根据2017年美国监测机构对于美国31个流感流行季的统计，H3N2主导了其中22个，而这期间流感的致病率和致死率是非H3N2流行季的2.7倍[27]。相比甲型，乙型的流感病毒更加稳定，乙型Yamagata株和乙型Victoria株已经流行40余年，还保持着流行株的主导位置[28]。流感与普通感冒在症状上类似，都伴随着乏力、头疼、咳嗽甚至高热等，但是普通感冒引发的症状在几天后会开始减轻，而流感则容易变得严重。严重的流感会引起：病毒型肺炎、急性呼吸窘迫综合征、休克、哮喘、充血性心力衰竭、继发细菌性肺炎、心血管和神经系统等多种并发症，最严重的会导致死亡[29,30]。抵抗力较差的人群，如老年人、儿童或有较严重病灶的患者，在感染流感病毒后容易发展为重症。虽然上述人群更易感染流感，但是流感仍可以影响各个年龄层，因为医疗资源使用的增加和损失的生产力，每年的流感都会导致严重的公共卫生和社会经济问题[31]，特别是在低收入国家和中等收入国家[32]。

武汉生物制品研究所2020届博士研究生毕业论文9图1.3流感病毒与对应疫苗发展历程Fig1.3Developmentofinfluenzavirusandcorrespondingvaccine1.3.1早期的流感疫苗1936年苏联的Smorodintseff将流感病毒在鸡胚中传代30次，发现这种多次传代的病毒对于实验者只会引起轻微的发热，因此这种方法被用来制备流感减毒活疫苗，并广泛使用在工人中[39]。同时代其他国家的资料显示流感减毒活疫苗在传代至足够安全时，对于没有天然免疫的青壮年有着较好的保护力，但是对于儿童和老人疫苗能提供的保护则很有限[40-42]。但是受制于当时的技术条件，流感减毒活疫苗仍存在隐患，如减毒株的稳定性、减毒株与野毒株重组的风险等。目前减毒活疫苗在美国等国家仍在使用，但是仅被用于免疫力较强的2~7岁儿童。美国和英国在二战期间开始研发流感灭活疫苗，主要是为军队提供保障[43]。在鸡胚尿囊液中培养流感病毒是一种相对简单的方法，澳大利亚的Burnet等人以此为基础开始制备流感疫苗[44]。美国的ThomasFrancis利用纯化手段在鸡胚尿囊液中获得了高浓度的病毒液，并用福尔马林进行灭活，从而制备了流感灭活疫苗[45]。同时使用的H1N1（PR8）株因为在尿囊液中复制能力比减毒株强，病毒的收获量也随之增大，极大地增加了疫苗的产量。早期流感病毒疫苗均为全病毒疫苗，副反应严重，1968年巴斯德公司首次使用裂解的方式制备流感疫苗，裂解后除去病毒核酸和不需要的大分子蛋白，仅保留抗原性较强的HA,NA,M及NP蛋白，这使接种后的不良反应大大减少。1976年亚单位疫苗成功被研发，该技术生产的流感疫苗仅含有HA和NA蛋白，有效抗原含量进一步提升。1.3.2鸡胚基质流感疫苗鸡胚基质流感疫苗是自流感疫苗诞生以来一直使用的方法，1944年Stanley等人撰写了鸡胚基质流?
【参考文献】

相关期刊论文 前6条

1 曾祥兴;李康生;;流感百年:20世纪流感大流行的回顾与启示[J];医学与社会;2010年11期

2 阿丽塔;许培扬;田玲;张玢;刘晓婷;;基于文献的1918年西班牙流感中国疫情分析[J];医学信息学杂志;2010年01期

3 万彬;陈萍;付莉;张志力;罗东霞;曹燕;;甲型H1N1流感患者的护理[J];中华护理杂志;2009年11期

4 流感研究上海协作组;吴迪;徐天磊;孙静;戴建新;丁国徽;何云刚;周正峰;熊慧;董辉;金维荣;边超;金力;王红艳;王小宁;杨忠;钟扬;王皓;车小燕;黄忠;蓝柯;孙兵;吴凡;袁政安;张曦;周晓农;周佳海;马志永;童光志;郭亚军;赵国屏;李亦学;曹志伟;;甲型H1N1流感病毒HA蛋白结构模建与构象表位分析[J];科学通报;2009年12期

5 任丽伟;陈强;徐贵江;李碧春;;禽流感病毒神经氨酸酶的研究进展[J];广东畜牧兽医科技;2009年02期

6 余元勋;;病毒包膜糖蛋白[J];国外医学(分子生物学分册);1983年02期

相关博士学位论文 前1条

1 平继辉;H9N2亚型禽流感病毒抗原变异及感染哺乳动物分子机制的研究[D];南京农业大学;2008年

相关硕士学位论文 前2条

1 古小兵;华东地区2011-2012禽流感流行病学调查及近三年H9N2禽流感病毒遗传进化分析[D];扬州大学;2013年

2 解茹;聚乙二醇修饰对蛋白质的脱酰胺与二硫键的影响研究[D];北京化工大学;2010年

本文编号：2870185