研究背景:肝癌(Hepatocelluar carcimona,HCC)是最常见的消化系统恶性肿瘤之一。乙型肝炎病毒感染及酗酒是导致肝硬化进而发生肝癌的重要危险因素。据统计,我国2018年的新发肝癌病例约392868人,占全世界的46.7%,死亡病例数占全球的47.2%。因此,肝癌严重威胁着我国人民群众的健康。肝切除术、肝移植术以及消融治疗是可能治愈肝癌的方法。但肝癌发病早期容易被忽略,确诊时多数都是中晚期病例,据统计只有约10%的患者有手术机会。肝移植术受限于米兰标准及供体短缺,而消融治疗更适合于早期肝癌。肝动脉化疗栓塞术(Transcatheter arterial chemoembolization,TACE)被多个指南或规范推荐为治疗中晚期肝癌的首选治疗方案。作为一种姑息治疗方案,TACE治疗在客观缓解率及生存获益方面存在局限。放射性粒子植入术作为一种内放射治疗方法,具有创伤小,局部控制率高,可重复性强的特点,在肝癌治疗方面受到越来越多的关注。随着多项临床研究的开展,不同治疗方式联合序贯治疗逐渐成为中晚期肝癌的治疗方向。碘125粒子是常用的放射源,其半衰期为59.6天,通过衰减过程发射出的低能量(27-35keV)的Y射线和x射线,主要通过干扰肿瘤细胞DNA合成,诱导细胞凋亡,起到杀伤肿瘤细胞的目的。碘125粒子有效组织穿透距离仅为20mm,在合理布源的情况下,对邻近重要脏器影响较小。理想的肿瘤放射治疗方案是以最小的生物有效剂量杀灭肿瘤,而正常组织不受到损伤。应用放射增敏剂是增加疗效、预防放射并发症的可行方法。在我国,碘125粒子被广泛用于肝癌、肺癌、胰腺癌、淋巴结转移瘤等多种实体肿瘤的治疗,并取得了良好的效果。既往研究表明,碘125粒子可诱导肝癌细胞凋亡,但其作用机制尚不明确。包含铂类药物的化疗方案在肝癌的化疗中占有主导地位,但其有效率仍有待提高。洛铂是铂类药物的第三代,具有毒性小,抗瘤效力强的优点。已有临床报道,采用洛铂的TACE联合碘125粒子植入术治疗中晚期肝癌具有优势。既往亦有研究显示,洛铂可诱导肝癌细胞凋亡,将肝癌细胞分裂阻滞在G2/M周期,而分裂在此期停滞的细胞对放疗更敏感,表明洛铂具有潜在的放射增敏作用,可能增加碘125粒子的疗效。洛铂与碘125粒子是否有协同作用,二者通过何种途径作用于肝癌细胞,未见文献报道。为了探索碘125粒子诱导肝癌细胞凋亡的可能途径,本课题应用等重标签标记用于蛋白质相对和绝对定量技术(Isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ)对HepG2肝癌细胞进行高通量蛋白质组学分析。将HepG2肝癌细胞分为照射组(碘125粒子给予2Gy、4Gy照射剂量)及对照组(未经碘125粒子照射),提取蛋白后,通过液相串联性质谱分析(Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry,LC-MS/MS),寻找差异蛋白,应用通路分析软件(Ingenuity Pathway Analysis,IPA)对差异蛋白富集的信号途径进行分析、筛选,发现照射组与对照组之间差异蛋白富集最显著的通路为eIF2信号路径。EIF2作为真核细胞翻译起始因子,参与调控全局及特定mRNA的表达,其参与的PERK-eIF2α-ATF4-CHOP通路是与细胞凋亡相关的重要通路,与内质网应激反应相关。内质网(Endoplasmic reticulum,ER)主要参与蛋白质合成、分泌与修饰、钙离子储存。ER功能受损会引起内质网应激反应,称为内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)。而ERS状态下,未折叠蛋白反应(Unfolded protein response,UPR)可被激活以保护细胞免受应激造成的损伤。UPR产生的结果依赖于细胞暴露在不利条件下持续的时间和强度,可能使细胞保持稳态,也可能介导细胞凋亡。一般情况下,UPR通过减少ER腔内蛋白质合成,增加蛋白质转运,降低ER负荷,使细胞存活。然而在不利条件持续存在的情况下,内质网稳态失衡,凋亡通路激活。其中,UPR可通过蛋白激酶 R 样内质网激酶(Protein kinase R like endoplasmic reticulum kinase,PERK)的磷酸化,调节真核细胞翻译起始因子2α(Eukaryotic translation Initiation factor 2α,eIF2α)、激活转录因子 4(Activating transcription factor 4,ATF4)、C/EBP 同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)的表达,诱导细胞凋亡。PERK-eIF2α-ATF4-CHOP通路在ERS中发挥重要作用。基于iTRAQ的研究结果及PERK-eIF2α-ATF4-CHOP通路的功能,我们推断碘125粒子可能通过诱导PERK-eIF2α-ATF4-CHOP途径上调,导致肝癌细胞凋亡。此外,前期临床研究表明,洛铂联合碘125粒子植入治疗肝癌效果更佳;细胞实验显示二者均可诱导肝癌细胞凋亡,因此我们推断洛铂与碘125粒子具有协同作用,洛铂可增强碘125粒子诱导的肝癌细胞凋亡和抑制增殖作用,而且这种增强可能通过调节PERK-eIF2α-ATF4-CHOP途径起作用。为了验证这些推断,本课题在肝癌细胞系和小鼠异种移植肿瘤模型中应用流式细胞术、EdU染色、TUNEL分析、siRNA转染、PERK-RNAi转染,Westernblot、qPCR、等技术方法对碘125粒子、洛铂的抗肿瘤效能及PERK-eIF2α-ATF4-CHOP途径在其中的作用进行了研究。研究目的:1、研究碘125粒子诱导肝癌细胞凋亡的作用途径;2、探讨洛铂对碘125粒子抗肿瘤作用的影响;3、研究PERK-eIF2α-ATF4-CHOP途径在洛铂、碘125粒子协同抗肿瘤中的作用。研究方法:1.蛋白质组学分析筛选碘125粒子诱导肝癌细胞凋亡的可能作用途径。应用碘125粒子照射HepG2肝癌细胞,分别给予OGy(对照组)、2Gy(A组)、4Gy(B组)照射剂量。在对照组和A组、B组中提取总蛋白进行iTRAQ高通量蛋白质组学分析,鉴定出差异蛋白,应用IPA进行差异蛋白功能分析,明确差异蛋白富集的信号路径,从而筛选碘125粒子诱导肝癌细胞凋亡的可能作用途径。2.正、反向验证PERK-eIF2α-ATF4-CHOP途径在碘125粒子照射肝癌中的作用2.1研究PERK-eIF2α-ATF4-CHOP信号通路在碘125粒子照射肝癌细胞中的改变。将HepG2细胞分为三组,应用碘125粒子体外照射模型,给予HepG2细胞OGy(对照组)、2Gy及4Gy照射,Western blot检测途径相关蛋白:PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、ATF4、CHOP 的表达;qPCR 检测途径相关mRNA:PERK、eIF2α、ATF4、CHOP的表达,通过细胞实验明确对照组与照射组途径相关蛋白及mRNA的表达差异及照射剂量对结果的影响。2.2通过体内实验研究PERK-eIF2α-ATF4-CHOP信号通路在碘125粒子植入治疗肿瘤中的变化。在小鼠皮下肿瘤模型中,将碘125粒子植入肿瘤。qPCR检测途径相关mRNA:PERK、eIF2α、ATF4、CHOP的表达,并与对照组比较,通过动物实验研究途径相关基因表达的差异性。2.3反向验证PERK-eIF2α-ATF4-CHOP途径在碘125粒子照射肝癌中的作用。将HepG2肝癌细胞分为3组,分别进行如下处理:Control-RNAi转染、Control-RNAi转染+碘125粒子、PERK-RNAi转染+碘125粒子。应用细胞增殖试验检测肝癌细胞增殖,应用Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡,比较PERK-RNAi转染与Control-RNAi转染的差异进行反向验证。3.研究洛铂对碘125粒子抗肿瘤作用的影响3.1测定洛铂在肝癌细胞中的增敏浓度。CCK-8检测经不同浓度梯度洛铂处理的肝癌细胞,应用GraphPad Prism 6.0绘制图形,计算半数抑制浓度(Inhibitory concentration 50,IC50)。测定洛铂在 HepG2 肝癌细胞株和SMMC7721肝癌细胞株中的增敏浓度。增敏浓度定义为IC50的10%。3.2测定洛铂对碘125粒子照射肝癌细胞的放疗增敏率。应用碘125粒子联合或者不联合洛铂分别对HepG2肝癌细胞株和SMMC7721肝癌细胞株进行处理,并应用克隆形成实验对细胞存活分数(Survival fraction,SF)进行分析,计算照射剂量4Gy时的SF,应用多靶单击模型计算测定洛铂对碘125粒子照射肝癌细胞的放疗增敏率。3.3研究洛铂对碘125粒子抗肿瘤作用的影响。分别将SMMC7721细胞及HepG2细胞分为四组,分别为对照组、单独洛铂组、单独碘125粒子照射组、洛铂+碘125粒子照射组。应用Annexin V-FITC/PI法及TUNEL实验检测细胞凋亡,明确洛铂对碘125粒子诱导的细胞凋亡是否有促进作用。应用RNase A/PI法检测细胞周期,EdU实验检测细胞增殖,明确洛铂对碘125粒子的肿瘤增殖抑制是否有促进作用。4.研究PERK-eIF2α-ATF4-CHOP途径在洛铂、碘125粒子协同抗肿瘤中的作用4.1研究PERK-eIF2α-ATF4-CHOP信号通路在洛铂、碘125粒子联合作用于肝癌细胞中的改变。将SMMC7721肝癌细胞分为四组,其中一组设为对照组,其它三组分别进行如下处理:单独洛铂、单独碘125粒子照射、洛铂+碘125粒子照射。Western blot检测PERK-eIF2α-ATF4-CHOP途径相关蛋白:PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、ATF4、CHOP。验证洛铂对碘 125 通过PERK-eIF2α-ATF4-CHOP途径介导的HCC细胞凋亡和抗增殖具有增强作用。4.2反向验证PERK-eIF2αα-ATF4-CHOP途径在碘125粒子和洛铂协同抗肿瘤中的作用。分别将SMMC7721和HepG2肝癌细胞分为3组,用不同方法处理:Control-RNAi转染、Control-RNAi转染+洛铂+碘125粒子、PERK-RNAi转染+洛铂+碘125粒子。RNase A/PI法检测细胞周期,Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡,同时应用Western blot检测Bax、Bcl-2蛋白表达,进一步验证PERK-eIF2α-ATF4-CHOP途径在碘125粒子和洛铂协同诱导HCC细胞凋亡和抑制增殖中的作用。4.3通过动物实验验证PERK-eIF2α-ATF4-CHOP途径在碘125粒子和洛铂协同抗肿瘤中的作用。应用SMMC7721肝癌细胞系建立裸鼠皮下成瘤动物模型,将16只裸鼠随机分为四组,每组四只,分别给予以下四种干预措施:Control-RNAi、碘 125 粒子+Control-RNAi、碘 125 粒子+洛铂+PERK-RNAi、碘125粒子+洛铂+Control-RNAi,每3天测量一次肿瘤直径及重量,记录数据并绘制生长曲线,30天后处死。比较各组肿瘤体积、重量变化,从动物实验进一步验证PERK-eIF2α-ATF4-CHOP途径及洛铂在碘125粒子介导的凋亡和抗增殖中的作用。结果:1.iTRAQ蛋白质组学分析结果鉴定对照组和经碘125照射2Gy、4Gy的HepG2细胞的差异表达蛋白,共鉴定到3379个蛋白。应用IPA进行差异蛋白功能分析,比较差异蛋白富集的信号通路,结果显示对照组与照射2Gy、4Gy组之间差异蛋白富集最显著的信号通路为eIF2信号路径。2.碘125粒子在肝癌中诱导PERK-eIF2α-ATF4-CHOP途径上调,而沉默PERK可使碘125粒子的作用减弱2.1 Western blot和qPCR结果表明,随着照射剂量的增加,PERK-eIF2α-ATF4-CHOP途径相关的蛋白质和基因的表达水平显著增加。2.2在小鼠肿瘤模型中,PERK-eIF2α-ATF4-CHOP途径相关基因的表达也在mRNA水平上调。2.3细胞增殖试验显示PERK-RNAi削弱了碘125粒子诱导的抗增殖作用。细胞凋亡检测显示PERK-RNAi转染的细胞凋亡率降低。3.洛铂增加了碘125粒子的照射敏感性;与单独治疗相比,二者联合治疗使肝癌细胞凋亡增加,对肝癌细胞的增殖抑制增强3.1 CCK-8检测表明洛铂可诱导HepG2和SMMC7721细胞凋亡,作用强度与剂量呈正相关。测得洛铂对HepG2和SMMC7721细胞的IC50值分别为5.972μg/mL 和 1.536μg/mL。3.2对于HepG2肝癌细胞系,单纯用碘125粒子照射4 Gy时,肝癌细胞SF为0.071±0.009,而碘125粒子照射和洛铂联合处理的SF为0.033±0.005;对于SMMC7721 细胞系,单纯粒子照射4Gy,SF为0.061±0.015,而联合治疗组SF为0.011±0.005。洛铂对碘125粒子照射HepG2和SMMC7721肝癌细胞的增敏率分别为1.37 和 1.63。3.3 流式细胞检测显示,碘125粒子和洛铂联合处理肝癌细胞时,肝癌细胞凋亡显著高于单独碘125粒子或洛铂处理。TUNEL实验结果表明,与单一治疗相比,联合治疗组细胞凋亡显著增加,洛铂增加了碘125粒子诱导的HepG2和SMMC7721肝癌细胞凋亡,SMMC7721细胞比HepG2细胞显示出更多的阳性结果。细胞增殖试验结果表明,单独应用碘125粒子或洛铂处理后,HepG2和SMMC7721细胞的生长受到抑制。联合治疗对肝癌细胞的生长抑制更显著。细胞周期分析的结果表明,碘125粒子和洛铂均在G2/M期诱导肝癌细胞周期停滞,联合治疗引起更显著的细胞周期停滞。EdU试验的结果表明,联合治疗组中的增殖细胞明显少与单独治疗组。4.洛铂增加了碘125粒子诱导的PERK-eIF2α-ATF4-CHOP途径的上调;沉默PERK后,洛铂和碘125粒子在肝癌治疗中的联合作用受到削弱4.1 Western blot 检测显示,碘 125 粒子可上调 PERK-eIF2α-ATF4-CHOP途径相关蛋白的表达。联合洛铂之后,碘125粒子的作用更加明显。4.2沉默PERK后,肝癌细胞G2/M阻滞比率、Bax/Bcl-2比率和凋亡率显著降低。沉默PERK可使碘125粒子和洛铂的协同作用减弱。4.3动物实验中,碘125粒子与洛铂联合治疗更显著地抑制肿瘤生长。PERK下调削弱了碘125粒子和洛铂联合治疗对裸鼠移植瘤的生长抑制作用。联合治疗组肿瘤重量、体积显著降低,结果与生长曲线一致。研究结论:1、碘125粒子通过上调PERK-eIF2α-ATF4-CHOP信号通路,诱导肝癌细胞凋亡、抑制肝癌增殖;2、洛铂对于碘125粒子治疗肝癌具有放射增敏作用;3、洛铂通过促进碘125粒子诱导的PERK-eIF2α-ATF4-CHOP通路上调增强碘125粒子诱导的肝癌细胞凋亡及增殖抑制。研究意义:本研究的发现,部分明确了碘125粒子治疗肝癌的作用机制,证明了洛铂对碘125粒子具有放射增敏作用,并明确了二者协同作用的可能机制,为肝癌的临床治疗提供理论基础,为肝癌的治疗提供了新的方向,为进一步研发肝癌治疗药物提供了新的靶标。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R735.7
【部分图文】：
图１：碘１２５粒ｐ
?山东大学博士学位论文???｜—３５?ｍｍ—｜??通气孔——：?ｊ????培养皿?；?ｙ??（３５?ｍｍ）?．?Ｉ?—?Ｉ?Ｉ?、?粒子??支架铅翠—粒子盘???（３?ｍｍ?厚）??图２：碘１２５粒子体外照射模型。由北京大学第三医院肿瘤放疗中心王俊杰教授友情提??供。此模型分为两部分，外部为一带有通气孔、厚度３ｍｍ铅罩，用于放射防护；内部??为厚度３ｍｍ聚苯乙烯板构成的上下两层结构，上层为细胞放置层，下层为粒子放置层。??上层板中央有一直径（Ｄｉａｍｅｔｅｒ，Ｄ）?３５ｍｍ的圆形浅槽，用以放置直径３５ｍｍ的细胞??培养皿；下层板中央有一直径为３５ｍｍ、圆周上等距离分布１４个凹槽的圆，凹槽为直??径０．８ｍｍ、高４．５ｍｍ的圆柱形，用以放置碘１２５粒子及防止粒子移位。上、下两圆中??心相对，中心点距离为１２ｍｍ。??５０??
?山东大学博士学位论文???Ｉ?Ｊ??｜?ＪＡＣＯ?Ｌ??ｗ＿ｃＬｓｒ?—乂??ｗ＼??图４：粒子植入装置。宁波君安药业公司提供的粒子植入装置包括两部分：粒子植入枪??及推杆。粒子植入时，将包含粒子的弹夹安装于粒子植入装置上，用推杆通过粒子植??入针的外套管将粒子植入。??５２??
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本文编号：
2870151
