目的:本文旨在通过两步离心法提取新西兰大白兔自体富血小板血浆,并研究富血小板血浆分泌的外泌体,对富血小板血浆来源外泌体进行分析鉴定;进一步探究富血小板血浆来源外泌体对体外骨关节炎软骨细胞的增殖凋亡影响以及与其相关的信号通路;观察富血小板血浆来源外泌体对动物模型中骨关节炎的治疗效果,为骨关节炎的早期治疗寻找有效的治疗手段,为富血小板血浆来源外泌体的临床成果转化提供坚定的理论支持及循证医学依据。方法:第一部分:抽取新西兰大白兔耳缘静脉血液,通过两步离心法提取自体富血小板血浆,然后利用外泌体提取试剂盒(exoEasy Maxi Kit)提取富血小板血浆来源外泌体(PRP-exos);利用透射电镜对富血小板血浆来源外泌体进行动态观察,利用纳米跟踪分析技术(NTA)分析其大小与浓度,采用免疫蛋白印迹(Westemblotting)明确富血小板血浆来源外泌体上的标志性蛋白分子;将提取的外泌体置于-80°液氮保存,备用。第二部分:剥离新西兰大白兔双膝软骨层,用胶原酶处理后分离和提取原代软骨细胞,经阿利新蓝、番红固绿及免疫组织化学(COL Ⅱ)染色鉴定;进一步传代培养后用于其他实验(三代内)。于P1代软骨细胞加入IL-1β(10ng/ml)模拟骨关节炎软骨细胞模型,并用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定软骨细胞释放的炎性因子TNF-α。按照如下分组进行试验:①对照组(Control组),②IL-1β组,③IL-1 β+PRP-as(5ug/ml)组,④IL-1 β+PRP-as(50ug/ml)组,⑤IL-1 β+PRP-exos(5ug/ml)组,⑥IL-1β+PRP-exos(50ug/ml)组。通过流式细胞术、细胞增殖实试验(CCK-8)、迁移试验、划痕试验来比较PRP-exos与激活的富血小板血浆(PRP-as)对骨关节炎模型中软骨细胞的影响,从而比较PRP-exos与PRP-as对骨关节炎软骨细胞的作用差异。通过Western Blotting测定骨关节炎模型软骨细胞经PRP-exos或PRP-as共培养后β-catenin、RUNX2和Wnt5a的表达,探究PRP-exos对骨关节炎模型软骨细胞作用的信号通路。第三部分:取24只清洁级新西兰大白兔,采用随机分组对照原则,分为空白对照组(Sham group)、模型组(Model group)和实验组,其中实验组又分为:①PRP-exos组(100ug/ml)、②PRP-as组(100ug/ml),每组6只(n=6)。空白对照组仅切开左膝关节囊,不做其他任何关节内处理,然后予以缝合;模型组和实验组则行改良Hulth法制作左膝关节骨关节炎模型(将内侧半月板切除,将内侧副韧带及前交叉韧带切断)。建模后7天内连续肌肉注射青霉素80万单位,每天一次,预防刀口感染。建模6周后将实验各组动物于耳缘静脉抽取自体静脉血1Oml,按照第一部分方法制备富血小板血浆及富血小板血浆来源外泌体,并进行蛋白浓度测定;然后按照实验组各组浓度要求行左膝关节腔注射;空白对照组与模型组关节腔内按相同方法注射等量生理盐水(0.6ml)。每周注射1次,连续注射6周后将各组动物处死。通过大体形态学观察、苏木素伊红染色(HE染色)、免疫组织化学染色(COL-2、RUNX2)、OARSI评分等方法比较PRP-exos与PRP-as在体内治疗骨关节炎的效果,观察有无统计学差异。结果:第一部分:本论文通过两部离心法成功从新西兰大白兔血浆提取出富血小板血浆,并进一步用外泌体提取试剂盒(exoEasy Maxi Kit)从中提取出富血小板血浆来源外泌体,并用透射电子显微镜(TEM)观察到PRP-exos是一种圆形或椭圆形的脂质双分子层结构的小囊泡;通过粒径分析仪,测出其直径范围为145.6±50.4 nm;采用蛋白免疫印迹(WB)可测定出PRP-exos的表面有CD9、CD63、CD81和HSP101的表达,其均为外泌体的特异性标志分子,更进一步证明富血小板血浆中外泌体的存在。第二部分:本研究成功提取出软骨细胞,并进行了传代培养。软骨细胞表现为三角形、多边形或纺锤形,该细胞的蛋白多糖沉积可被阿尔新蓝染成蓝色,而经番红固绿染色可见细胞基质为深红色,进一步对该细胞进行免疫组织化学染色(COL-II),表现为细胞核呈蓝色,细胞质呈现棕褐色,这些染色结果均可有效证明提取的细胞为软骨细胞。在体外试验中,本研究发现IL-1β(10ng/ml)可成功诱导软骨细胞炎性改变,明显增加TNF-α的释放,采用ELISA测定IL-1β组TNF-α的OD值为2.58±0.11,与对照组相比明显增加(P0.05)。在加入不同浓度PRP-exos及PRP-as后,测定各组TNF-α的OD值(PRP-exos 5ug/ml:2.16±0.08;PRP-exos 50ug/ml:2.05±0.13;PRP-as 5ug/ml:2.25±0.06;PRP-as50ug/ml:2.08±0.04;P0.05)均明显下降,而各浓度组之间相比,无明显统计学差异(P0.05)。在体外细胞增殖试验中,用IL-1β(10ng/ml)模拟骨关节炎软骨细胞,在加入不同浓度的PRP-exos和PRP-as(5ug/ml、50ug/ml)后,经CCK8试验发现,试验组在培养24h、48h、72h、120h后软骨细胞均较诱导组明显增殖(P0.05);且高浓度组在各个时间段均是PRP-exos组优于PRP-as组(P0.05),而低浓度组在培后24h、48h时PRP-exos组优于PRP-as组(P0.05),在培养72h、120h后两者无明显统计学意义(P0.05)。通过细胞凋亡研究(流式细胞术),我们发现高浓度的PRP-exos及PRP-as均显著抑制经IL-1β(10ng/ml)诱导的软骨细胞凋亡(PRP-exos 50ug/ml:10.45±0.36;PRP-as50ug/ml:12.34±0.42;诱导组13.85±0.34,P0.05),且PRP-exos的作用效果明显好于PRP-as,具有统计学差异(P0.05)。但是,在低浓度组,两者对诱导组软骨细胞凋亡的抑制效果差别不显著,无统计学差异(P0.05)。在体外细胞迁移试验中,我们研究发现IL-1β(10ng/ml)显著地抑制软骨细胞的迁移;而PRP-exos与PRP-as均可明显促进软骨细胞迁移,且在相同浓度时前者的作用效果大于后者,同时高浓度的PRP-exos及PRP-as的作用效果均大于低浓度组。通过细胞划痕试验我们发现在连续培养6h、12h后仅有高浓度PRP-exos可促进软骨细胞明显迁移(P0.05),而其他各组对软骨细胞的迁移作用无统计学意义(P0.05)。在用Western blotting进行的相关信号通路研究中,我们发现经IL-1β诱导的骨关节炎软骨细胞可使Wnt/β-catenin信号通路中的β-catenin、RUNX2和Wnt5a均高表达,而加入PRP-exos和PRP-as后可使其降低表达,具有明显统计学意义(P0.05),其中对RUNX2和Wnt5a表达的降低作用PRP-exos要大于PRP-as(P0.05),而对β-catenin表达的降低作用PRP-exos要小于PRP-as(P0.05)。第三部分:本次动物实验研究中无意外死亡发生。根据改良Hulth法成功制作出新西兰大白兔左膝关节骨关节炎模型,并进行随机对照分组实验。建模6周后将实验动物利用空气栓塞法处死,获取标本,经大体形态学发现,模型组即OA组膝关节出现滑膜组织水肿,股骨内髁软骨呈暗灰色,触摸表面不平整,股骨内髁可见部分软骨变薄,周围多发骨赘形成,而PRP-exos组和PRP-as组骨关节炎改变均较模型组轻。通过HE染色发现模型组软骨表面局灶性增生,软骨细胞排列不规则,边界模糊,而PRP-exos及PRP-as组则均有明显改善,关节软骨表面尚完整,颜色较OA组正常,无关节软骨面缺损;进一步通过软骨细胞计数发现,PRP-exos组与PRP-as组均可显著使软骨细胞增加(P0.05),而且PRP-exos的作用要大于PRP-as组(P0.05)。通过对标本进行COL Ⅱ和RUNX2免疫组织化学染色,我们发现PRP-exos和PRP-as均可逆转骨关节炎引起的Ⅱ型胶原蛋白表达减少并抑制RUNX2蛋白的表达,促进软骨修复,并且前者的作用大于后者(P0.05)。根据OARSI推荐的评分显示,OA组的评分较对照组明显升高(P0.05),而PRP-exos组的评分及PRP-as的评分较OA组降低,说明PRP-exos及PRP-as均可有效抑制骨关节炎(P0.05);且PRP-exos的评分低于PRP-as,表明PRP-exos抑制骨关节炎的作用大于PRP-as(P0.05)。结论:本研究成功地从新西兰大白兔血液中提取富血小板血浆,并从中提取和鉴定分析了富血小板血浆来源的外泌体。本研究成功提取了兔软骨细胞,并于体外经IL-1β诱导成功建立了体外骨关节炎软骨细胞模型。通过研究发现富血小板血浆来源外泌体可以促进经IL-1β诱导的骨关节炎软骨细胞的增殖和迁移,抑制软骨细胞凋亡。PRP-exos通过Wnt/β-catenin信号通路中的相关蛋白表达及负表达,从而达到抑制骨关节炎的效果。由于PRP-exos在缓解骨关节炎方面的作用大部分明显优于PRP-as,或有部分与其相似,因此我们认为富血小板血浆来源外泌体可能在关节腔注射富血小板血浆治疗骨关节炎方面起主导作用。综上所述,我们认为富血小板血浆来源的外泌体(PRP-exos)具有潜在的治疗骨关节炎的作用,通过关节腔注射PRP-exos可以作为治疗骨关节炎的新手段,为今后骨关节炎临床治疗的探索和应用提供一种新的途径。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R684.3
【部分图文】：
图３ｂ??２１??
源外泌体，其所测得直径约为１４５．６±５０．４ｎｍ，颗粒浓度约为４．６７土０．２１＊１０八６??ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｌ?（如图?３ｂ?戶亓示）。??４．ＰＲＰ－ｅｘｏｓ的表面特异性标志物表达结果??为了研宄ＰＲＰ－ｅｘｏｓ的生物学特性，我们将提取的ＰＲＰ－ｅｘｏｓ进行了蛋白免疫??印迹（Ｗｅｓｔｅｒｎ?Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）检测，来寻找提取物表面的标志性蛋白。结果显示：夕卜??泌体的特异性标志性蛋白ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＨＳＰ１０１均在ＰＲＰ－ｅｘｏｓ上特异性??表达，这充分说明我们从ＰＲＰ中提取的液体是富血小板血浆来源的外泌体。这??也为我们后续试验研究成功奠定了基础。蛋白免疫印迹检测结果如下图４所示。??
?山东大学博士学位论文???????附录??」??ｆｉｋ??图１：?Ａ处死新西兰大白兔后消毒双侧膝关节；Ｂ剥离包裹软骨组织的筋膜和软??骨膜，放入盛有ＰＢＳ液的培养皿中；Ｃ将所得软骨组织修剪，切成约０．３－０．５ｍｍ。??＿縱ｊ??，＃?？？?？？？？?？＊?．?？?？?－?＊?ｉ?／？?＊，Ｕｆ?■，??．？？？?ｖ．．，＊１＾ｆ??＇，．，？？?＇．之？：＇？?＇，＜?＾?－，丄．??Ｃ?Ｄ??图２：?Ａ提取的原代软骨细胞（２０〇ｘ）?；?Ｂ软骨细胞经阿利新蓝染色结果（４０〇ｘ）；??Ｃ软骨细胞经番红固绿染色结果（４００＞０?；?Ｄ软骨细胞经ＣＯＬ?ＩＩ免疫组织化学??染色结果（４０〇ｘ）。??４８??
【相似文献】
相关期刊论文 前10条
1 蔡伟平,汤亭亭;骨关节炎的细胞生物学研究进展[J];国外医学(骨科学分册);2004年01期
2 赵晶鹏;邓国英;周峰;纪安琪;翟玥;沙一帆;王秋根;王谦;张菲;吴剑宏;;光热效应及年龄因素对软骨细胞及骨关节炎模型制备的影响[J];国际骨科学杂志;2017年06期
3 李灿锋;陈卓;杨静;周宗科;康鹏德;裴福兴;沈彬;;miR-140在不同阶段骨关节炎软骨细胞中的表达规律及功能[J];实用骨科杂志;2017年11期
4 向阳,袁国华;抗软骨细胞膜抗体与类风湿关节炎和骨关节炎关系的研究[J];恩施医专学报;1996年01期
5 孟迪;景金珠;王莹;梁震;;骨髓间充质干细胞源外泌体对软骨细胞迁移、增殖和凋亡的影响[J];医学研究杂志;2020年01期
6 刘笑君;杨朝晖;赵瑞鹏;;TRPM4通道抑制剂9-菲酚在骨关节炎软骨细胞中的作用[J];中华临床医师杂志(电子版);2017年18期
7 袁国华,向阳,施桂英;骨关节炎患者血清抗软骨细胞抗体测定及其意义[J];中华风湿病学杂志;1997年01期
8 胡浩然;谢雪涛;张长青;;骨关节炎中软骨细胞自噬的研究进展[J];中华关节外科杂志(电子版);2018年06期
9 陈颖颖;李冬霞;杜梦梦;胡琪;何春晓;陶庆文;;软骨细胞生物钟紊乱与骨关节炎[J];风湿病与关节炎;2018年11期
10 张兰玲,管剑龙,韩星海;骨关节炎软骨移植的研究进展[J];中华风湿病学杂志;2003年04期
相关博士学位论文 前10条
1 刘绪昌;富血小板血浆来源外泌体在治疗兔膝骨关节炎中的作用及机制研究[D];山东大学;2020年
2 刘成磊;多模态影像对膝骨关节炎骨-软骨的定量研究[D];上海交通大学;2018年
3 张强;YAP1调控软骨细胞自噬在骨关节炎中的作用和分子机制[D];中国医科大学;2019年
4 王孟宏;1.SHED外泌体miR-100-5p抑制mTOR缓解颞下颌关节骨关节炎 2.疼痛中心性量表在疼痛颞下颌关节紊乱病中的应用[D];重庆医科大学;2019年
5 张赐童;软骨细胞通过转录因子FoxO1促进骨折愈合中血管的形成[D];吉林大学;2019年
6 孙恒;丝素修饰左旋聚乳酸多孔微球构建可注射组织工程软骨的研究[D];北京协和医学院;2019年
7 靖兴志;炎性环境下铁离子稳态失衡在OA病理进程中的作用和机制研究[D];华中科技大学;2019年
8 储沨婷;颅底软骨细胞体外循环张应变加载研究[D];上海交通大学;2014年
9 于川东;miR-126沉默能够上调Bcl-2并且能通过抑制MAPK和JNK信号通路活性来减轻IL-1β诱导的软骨细胞炎症损伤[D];山东大学;2018年
10 李明;股骨头坏死相关基因的相关性、多态性及保护性研究[D];山东大学;2018年
相关硕士学位论文 前10条
1 童迅;血管细胞粘附分子-1在骨关节炎发病机制中的初步研究[D];第四军医大学;2013年
2 王林林;体外兔软骨细胞的分离，培养与鉴定的研究[D];新乡医学院;2015年
3 赵瑞鹏;体外间接共培养兔膝关节软骨单位对软骨细胞生物学特性的影响[D];山西医科大学;2017年
4 魏奥;马BMSCs成软骨细胞诱导分化过程中关键lncRNA与mRNA的筛选与互作[D];内蒙古农业大学;2019年
5 谢文斌;人膝关节OA原位软骨细胞自发性钙离子信号特征分析[D];湖南师范大学;2017年
6 桂志鹏;槲皮素对软骨细胞的生物学调控及其机理研究[D];上海交通大学;2018年
7 丁晓;成骨细胞通过ERK信号通路调节软骨细胞表达ADAMTs、MMPs的实验研究[D];石河子大学;2019年
8 张伟;低分子量黄原胶抑制氧化应激状态下软骨细胞凋亡的机制研究[D];锦州医科大学;2019年
9 王皓;FGF18和KGN联合应用对软骨细胞的影响[D];新乡医学院;2019年
10 沈星宇;骨性关节炎中软骨细胞力学研究[D];哈尔滨工业大学;2019年
本文编号：
2868503
