PKM2促进结肠癌细胞迁移、粘附及炎症因子分泌的机制研究

发布时间：2020-11-03 02:18

　　 结直肠癌(colorectal cancer, CRC)作为消化系统最常见的恶性肿瘤,全球每年新发病例超过120万,并且每年约有60万人死于CRC。手术切除原发性肿瘤是治疗结直肠癌的首选方式,但手术后因感染诱发的炎症反应及肿瘤远端转移是导致CRC患者预后较差的主要原因。肿瘤转移是一个多因素、多基因参与的过程,包括细胞与细胞间的粘附降低、细胞与细胞外基质的粘附能力增强、基质金属蛋白酶降解细胞外基质等。其中,细胞迁移和粘附是肿瘤迁移能力的重要指标。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)作为革兰氏阴性菌外膜上的一种糖蛋白,可引起全身炎症反应和严重败血症,与CRC术后腹内感染并发症有关。结直肠癌患者手术后,LPS含量会明显上升并引起炎症反应。然而LPS在CRC进程中的明确作用目前仍不清楚。因此,研究CRC粘附、转移及炎症微环境改变诱导CRC恶性转化的分子机理,对减少CRC患者的发病率和死亡率具有重要意义。无论氧气存在与否,肿瘤细胞主要依赖糖酵解而不是氧化磷酸化进行葡萄糖代谢,这一糖代谢异常现象称为Warburg效应。目前认为,M2型丙酮酸激酶在Warburg效应中发挥着重要作用。丙酮酸激酶(Pyruvate kinase, PK)作为糖酵解途径的限速酶,能够将磷酸烯醇式丙酮酸转变成丙酮酸。PKM1和PKM2作为PK最为常见的两个亚型,由PKM基因经选择性剪接产生。PKM1蛋白主要在除了肝、肾和血红细胞之外的正常细胞中高表达,而PKM2蛋白则在干细胞和肿瘤细胞中高表达。PKM1具有稳定的四聚体结构,不受别构调节。PKM2受到别构调控,并在肿瘤细胞内发生二聚体和四聚体间转化。PKM2四聚体具有较高的丙酮酸激酶活性,而二聚体形式则具有蛋白激酶活性,两种活性的转换为肿瘤细胞提供生长优势和对微环境的适应能力。已有报道显示,PKM2在肿瘤细胞增殖、恶性转化、血管生成和细胞周期进展中发挥着重要作用。然而,PKM1和PKM2在结肠癌细胞粘附、转移及炎症微环境的作用仍不明确。本文通过构建稳定敲低PKM的DLD1细胞株以及稳定过表达PKM1、PKM2及PKM2不同活性突变体的DLD1细胞株,分别探讨了PKM1与PKM2在结肠癌细胞迁移与粘附、炎症因子分泌与增殖调控中的作用与机制；通过原核表达GST-PKM1、 GST-PKM2融合蛋白来模拟分泌型PKM1和PKM2,检测其对结肠癌细胞迁移能力的影响并探讨其作用机制。获得以下研究结果：1.通过构建敲低PKM、过表达PKM1、PKM2以及过表达PKM2的K367M、R399E和K433E等突变体的慢病毒表达载体。采用慢病毒包装、收获、转染结肠癌DLD1细胞,经puromycin筛选、qPCR和western blot技术检测,得到稳定细胞株。2.通过细胞划痕法和细胞基质粘附实验,我们发现过表达PKM2,而不是PKM1,能够明显促进结肠癌细胞迁移及粘附。qPCR和western blot结果显示,过表达PKM2能明显提高N-cadherin、MMP-2、MMP-9、Snail-2的表达,促进FAK的磷酸化以及β1-integrin的活化,并抑制E-cadherin的表达。敲低PKM能明显逆转PKM2诱导的迁移粘附相关信号分子的表达。特别是过表达PKM2能够上调STAT3的mRNA水平、蛋白水平、磷酸化水平以及STAT3的核转位。放线菌素D实验显示,PKM2上调STAT3的表达主要是通过调控其转录水平,而不是通过抑制mRNA降解。在过表达PKM2的细胞株中瞬时敲低STAT3的表达,结果表明,敲低STAT3能够有效逆转PKM2诱导的迁移粘附相关信号分子的表达及细胞迁移。通过检测PKM2不同活性点突变的稳定细胞株中丙酮酸激酶活性、STAT3的表达和磷酸化水平以及细胞迁移能力,发现DLD1-R399E细胞缺乏丙酮酸激酶活性,能明显增加STAT3和磷酸化STAT3的表达,促进结肠癌细胞迁移。3.LPS可以明显促进DLD1细胞中PKM2、TNF-α、IL-1β的表达,并具有浓度依赖性,而PKM1的表达不受LPS影响。同时发现LPS可以促进DLD1细胞增殖。Western blot、qPCR、ELISA以及MTT结果显示,敲低PKM能够抑制LPS诱导的TNF-α、IL-1β的表达、分泌以及结肠癌细胞增殖。过表达PKM2可以明显促进TNF-αIL-1β的表达以及LPS诱导的结肠癌细胞增殖。NF-κB的抑制剂BAY-11-7082能够明显抑制LPS诱导的NF-κB亚基p65、PKM2的表达。敲低PKM能显著抑制LPS诱导的STAT3的表达和核转位,而对LPS诱导的p65的表达和核转位无影响。在过表达PKM2细胞中瞬时敲低STAT3,可以逆转由PKM2引起的TNF-a和IL-1β的表达。染色质免疫共沉淀结果显示,LPS能促进PKM2与STAT3启动子的结合,通过促进STAT3的转录来调控TNF-α、IL-1β的表达。DLD1-R399E细胞能明显促进STAT3的表达和]TNF-α、IL-1β的分泌。4.通过原核表达纯化GST-PKM1、GST-PKM2处理DLD1细胞模拟分泌型PKM1、PKM2的功能,发现分泌型PKM2能促进结肠癌细胞迁移。敲低PKM2能明显减少PKM2的分泌及由分泌型PKM2诱导的结肠癌细胞迁移。分泌型PKM2能促进MMP-2、MMP-9、N-cadherin、β、catenin勺表达,抑制E-cadherin的表达。分泌型PKM2能够促进Akt的磷酸化,而PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002能抑制分泌型PKM2诱导的结肠癌细胞迁移及E-cadherin、N-cadherin和β-catenin的表达。采用siRNA干扰β-catenin表达,可以明显逆转分泌型PKM2诱导的E-cadherin、 N-cadherin的表达。综上所述：PKM2依赖其蛋白激酶活性而不是丙酮酸激酶活性,调控STAT3转录,促进结肠癌细胞迁移和粘附。LPS通过诱导PKM2表达、增强PKM2与STAT3基因启动子结合、加强STAT3的表达与核转位,调控结肠癌细胞TNF-a和IL-1p的表达与分泌。分泌型PKM2能通过PI3K/Akt和β-catenin信号通路促进结肠癌细胞迁移。因此,PKM2在结肠癌细胞迁移、粘附、炎症因子的分泌调控中发挥着重要作用,可作为结直肠癌转移和术后炎症反应诊治的靶点。
【学位单位】：山西大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R735.35
【文章目录】：
中文摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
    1 Warburg效应与PKM2
    2 PKM2概述
        2.1 PKM2的表达调控
            2.1.1 PKM的表达调节
            2.1.2 PKM基因的选择性剪接
            2.1.3 表观遗传及microRNA调控
            2.1.4 PKM2蛋白稳定性调控
        2.2 PKM2的活性调控
            2.2.1 代谢中间产物对PKM2的活性调控
            2.2.2 翻译后修饰对PKM2的活性调控
        2.3 PKM2对肿瘤代谢的调控
        2.4 PKM2对细胞信号通路的调控
        2.5 PKM2的临床应用
    3 本课题的研究意义及研究内容
第二章 PKM1和PKM2不同活性突变体的稳定表达细胞株的建立
    1 引言
    2 材料与方法
        2.1 实验材料
            2.1.1 细胞、菌株与质粒
            2.1.2 试剂与抗体
            2.1.3 主要试剂配制方法
            2.1.4 主要仪器设备
        2.2 实验方法
            2.2.1 细胞培养
            2.2.2 细胞的冻存与复苏
            2.2.3 RNA提取、反转录cDNA
            2.2.4 PKM1、PKM2慢病毒表达载体的构建
            2.2.5 PKM2不同点突变慢病毒载体K367M、R399E和K433E的构建
            2.2.6 稳定敲低PKM慢病毒载体的构建
            2.2.7 慢病毒包装
            2.2.8 DLD1细胞株转染和筛选
            2.2.9 荧光定量PCR和western blot鉴定稳定细胞株
    3 结果
        3.1 稳定敲低PKM的结肠癌细胞株的获得及检测
        3.2 稳定过表达PKM1、PKM2的结肠癌细胞株的获得及检测
        3.3 PKM2不同活性突变体的稳定过表达细胞株的获得及检测
    4 讨论
第三章 PKM2过表达影响结肠癌细胞迁移与粘附的分子机制
    1 引言
    2 材料与方法
        2.1 实验材料
            2.1.1 细胞、菌株与质粒
            2.1.2 试剂与抗体
            2.1.3 主要试剂配制方法
            2.1.4 主要仪器设备
        2.2 实验方法
            2.2.1 细胞培养
            2.2.2 实时定量PCR分析
            2.2.3 细胞浆蛋白、核蛋白抽提和western blot分析
            2.2.4 细胞划痕实验
            2.2.5 细胞基质粘附实验
            2.2.6 siRNA转染敲低STAT3
            2.2.7 丙酮酸激酶活性分析
            2.2.8 统计分析
    3 结果
        3.1 敲低PKM抑制了结肠癌细胞的迁移
        3.2 敲低PKM抑制了结肠癌细胞与基质的粘附作用
        3.3 敲低PKM引起结肠癌细胞迁移与粘附变化的分子机制
        3.4 过表达PKM2能促进结肠癌细胞的迁移和粘附
        3.5 过表达PKM2逆转结肠癌细胞迁移、粘附相关的信号
        3.6 PKM2调控STAT3表达的机制
        3.7 PKM2通过调控STAT3表达来促进DLD1细胞迁移和细胞基质粘附
        3.8 PKM2促进结肠癌细胞迁移和粘附依赖其蛋白激酶活性
    4 讨论
第四章 PKM2促进结肠癌细胞炎症因子分泌及增殖的分子机制
    1 引言
    2 材料与方法
        2.1 实验材料
            2.1.1 细胞
            2.1.2 试剂与抗体
            2.1.3 主要试剂配制方法
        2.2 实验方法
            2.2.1 细胞培养
            2.2.2 细胞浆蛋白、核蛋白抽提和western blot分析
            2.2.3 MTT法检测LPS对结肠癌细胞增殖的影响
            2.2.4 qPCR分析
            2.2.5 酶联免疫吸附实验（ELISA）检测TNF-α与IL-1β的分泌
            2.2.6 siRNA转染敲低STAT3
            2.2.7 免疫质免疫共沉淀（ChIP）分析
            2.2.8 丙酮酸激酶活性分析
            2.2.9 统计分析
    3 结果
        3.1 LPS促进DLD1细胞TNF-α与IL-1β的表达与细胞增殖
        3.2 LPS诱导DLD1细胞中炎症因子的表达和代谢改变
        3.3 敲低PKM能逆转LPS引起的结肠癌细胞炎症因子的表达与增殖
        3.4 PKM2过表达促进LPS诱导的DLD1细胞炎症因子的表达与增殖
        3.5 NF-κB信号调控LPS诱导的PKM2的表达
        3.6 PKM2通过上调STAT3表达来调控TNF-α和IL-1β的表达
        3.7 ChIP检测PKM2结合STAT3启动子
        3.8 LPS同时诱导了胞内PKM2的丙酮酸激酶及蛋白激酶活性
        3.9 PKM2诱导的炎症因子分泌依赖其蛋白激酶活性
    4 讨论
第五章 分泌型PKM2对结肠癌细胞迁移的影响及分子机制
    1 引言
    2 材料与方法
        2.1 实验材料
            2.1.1 细胞、菌株与质粒
            2.1.2 试剂与抗体
            2.1.3 主要试剂配制方法
        2.2 实验方法
            2.2.1 细胞培养及条件培养基的收集
            2.2.2 重组表达质粒pGEX-4T-1-PKM1和pGEX-4T-1-PKM2的构建
            2.2.3 重组蛋白GST-PKM1、GST-PKM2的表达与纯化
            2.2.4 细胞划痕法检测细胞迁移
            2.2.5 实时定量PCR检测mRNA变化
            2.2.6 Western blot检测蛋白变化
            2.2.7 瞬时转染敲低β-catenin、PKM2
            2.2.8 PI3K信号通路抑制剂LY294002对细胞迁移的影响
            2.2.9 统计学分析
    3 结果
        3.1 结肠癌细胞系中分泌型PKM1、PKM2的检测
        3.2 重组表达质粒pGEX-4T-1-PKM1和pGEX-4T-1-PKM2的构建
        3.3 重组蛋白GST-PKM1、GST-PKM2的表达与纯化
        3.4 分泌型PKM2促进结肠癌DLD1细胞迁移
        3.5 敲低PKM2抑制PKM2的分泌及DLD1细胞的迁移
        3.6 分泌型PKM2活化p-catenin信号通路
        3.7 分泌型PKM2激活PI3K/Akt促进结肠癌细胞迁移
    4 讨论
总结与展望
参考文献
个人简历及读博期间发表文章
致谢
承诺书


本文编号：2867949