不同激活状态的小胶质细胞对潜在癫痫易感性-代谢型谷氨酸受体的影响

发布时间：2020-11-08 13:05

　　 研究背景和目的:癫痫是一类以脑内神经元异常同步放电为特点的中枢神经系统疾病,目前全球约有7000万人罹患此病,因此癫痫成为发病率最高与最严重的神经系统疾病之一,给个人、家庭及社会带来了沉重的负担。癫痫的发病机制复杂,通常认为在其发病过程中存在神经元的过度兴奋,即存在谷氨酸能信号转导的兴奋性神经递质和γ-氨基丁酸能信号转导的抑制性神经递质的失衡。目前癫痫治疗策略的选择主要以其发病机制为基础,但仍有至少1/3患者的病情不能得到良好的控制。因此,对于癫痫发病机制的深入研究显得尤为重要。近年来,大量研究证实在癫痫发病过程中伴有免疫紊乱或异常,目前也有越来越多的研究侧重于癫痫的神经免疫与神经炎症机制,而小胶质细胞作为其中重要的免疫学因素也逐渐成为研究的焦点与热点。小胶质细胞是脑内最重要的免疫细胞之一,在维持正常神经功能和参与疾病的病理生理过程中都起到不可忽视的作用。生理条件下,小胶质细胞的功能包括免疫监视,参与神经细胞及少突胶质细胞发生,促进神经细胞生存,清除凋亡神经元以及调节突触可塑性等。然而在过度激活的状态下,小胶质细胞则可能产生并释放过量的一氧化氮等神经毒性物质,引起剧烈的氧化应激反应并诱导神经细胞死亡或损伤。在癫痫脑组织中,小胶质细胞既可以表现为促癫痫性也可以表现为抗癫痫性,可能与其多态性有关。在此基础上,代谢型谷氨酸受体(metabotropic gluatamate receptor,m Glu R)兴奋后可能诱导小胶质细胞转换为更加复杂的表型,因此研究者们更需要关注小胶质细胞在癫痫发病的不同时期中的角色变化。迄今,针对代谢性谷氨酸受体兴奋的静息型、促炎型(M1)与抑炎型(M2)小胶质细胞对神经元兴奋性影响的研究较少,因此,本研究拟建立不同激活状态的小胶质细胞模型,以此为基础研究小胶质细胞自身功能的变化与其机制以及对神经细胞的影响,并侧重于寻找小胶质细胞与癫痫产生相关的细胞生存通路和病理性通路并验证其作用,探讨调节小胶质细胞激活和炎症反应作为癫痫治疗策略的可能性。研究方法:(1)取N13小胶质细胞系进行传代培养,应用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、白细胞介素-4(interleukin,IL-4)/白细胞介素-10(interleukin,IL-10)/转化生长因子β(transforming growth factorβ,TGF-β)以及DHPG、LY 354740、L-AP4等m Glu R激动剂分别建立静息状态、促炎状态以及抑炎状态下的小胶质细胞代谢型谷氨酸受体激活模型,应用荧光测定法、ELISA等方法检测一氧化氮(nitric oxide,NO)释放量、白细胞介素-1β(interleukin,IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin,IL-6)、IL-4、肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor alpha,TNF-α)等细胞因子释放量。(2)取N13小胶质细胞系进行传代培养,应用LPS以及DHPG、L-AP4等m Glu R激动剂建立静息状态以及促炎状态下的小胶质细胞代谢型谷氨酸受体激活模型,应用Western Blot、q PCR等方法检测小胶质细胞炎症通路及谷氨酸通路关键通路蛋白及长链非编码RNA的表达水平。(3)取C1300神经元细胞系进行传代培养,应用上述不同状态的小胶质细胞上清液刺激神经元,建立静息状态、促炎状态以及抑炎状态下的小胶质细胞m Glu R激活后刺激神经细胞的模型,通过检测CCK8、LDH水平、谷氨酸释放量等评估神经元活性及损伤程度,Western Blot检测N-甲基-D-天冬氨酸(n-methyl-d-aspartate,NMDA)受体、钙调素依赖性蛋白激酶II(calmodulin-dependent protein kinase II,Cam K II)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitricoxide synthase,i NOS)等兴奋性相关通路蛋白表达或激活水平。(4)本研究的数据用统计学软件SPSS 22(SPSS,USA)分析,数据以平均值±标准差(SD)表示。应用单因素方差分析(ANOVA)和Tukey′s post hoc检验进行组间比较。对于本研究中的所有数据,设定P0.05表示数据之间有显著性差异,具有统计学意义。研究结果:(1)对于M1型小胶质细胞,激活m Glu R I可以使IL-1β、IL-6释放减少以及使IL-4、TNF-α释放增加。m Glu R II的激活可以使IL-1β释放增多。m Glu R III的激活可以使IL-6释放减少,以上数据与对照组相比均有统计学差异。(2)对于M2型小胶质细胞,m Glu R I的激活可以使IL-6与IL-4释放增加以及TNF-α释放减少。m Glu R II的激活可以使IL-4释放增多以及TNF-α释放减少。m Glu R III的激活可以使IL-1β释放减少、IL-6以及IL-4释放增加,以上数据与对照组相比均有统计学差异。(3)DHPG和L-AP4都可以抑制M1型小胶质细胞p-NF-κb p65的表达,从而起到对激活的NF-κb信号通路的抑制作用。DHPG和L-AP4刺激的静息状态和M1型小胶质细胞可以上调p-PKA的表达。DHPG和L-AP4可以降低M1型小胶质细胞p44/42 MAPK水平,以上数据与对照组相比均有统计学差异。(4)M1型小胶质细胞受DHPG刺激后,PI3K-Kinase p85α与GSK-3β的表达水平均上调,与对照组相比有统计学差异。但M1型小胶质细胞受L-AP4刺激后,PI3K-Kinase p85α的表达水平与对照组相比无统计学差异,但GSK-3β的激活水平则被抑制,与对照组相比有统计学差异。(5)m Glu R I的激活可以增强M1型小胶质细胞中linc RNA-COX2和linc RNA-EPS表达,与对照组相比有统计学差异。当M1型小胶质细胞m Glu R III激活时,linc RNA-COX2和linc RNA-EPS的表达均有明显下调,与对照组相比有统计学差异。(6)M1型小胶质细胞受DHPG的刺激以及M2型小胶质细胞受L-AP4刺激的上清液都可以使神经细胞的活力增加并显著降低神经细胞死亡与损伤,与对照组相比有统计学差异。(7)静息状态的小胶质细胞受DHPG激活后上清液倾向于增加神经细胞谷氨酸的释放,而DHPG激活的M1型小胶质细胞以及L-AP4激活的M2型小胶质细胞的上清液都可以减少神经细胞谷氨酸的释放,以上数据与对照组相比均有统计学差异。(8)M1型小胶质细胞当受到DHPG及L-AP4刺激时上清液可以减少神经细胞NR1、NR2A及NR2B的活化水平并增加Ca MK II的活化水平。LY 354740激活的M1型小胶质细胞上清液倾向于降低神经细胞NR2B的活化水平。DHPG激活的M2型小胶质细胞上清液可以上调NR2A及NR2B的激活水平,LY 354740激活的M2型小胶质细胞上、清液可以抑制NR2A的激活,L-AP4激活的M2型小胶质细胞上清液可以下调神经细胞NR1与NR2A的活化水平。DHPG及LY 354740激活的M2型小胶质细胞上清液可以显著增加Ca MK II的活化水平,以上数据与对照组相比均有统计学差异。(9)M1型小胶质细胞的NO产量较静息状态的小胶质细胞相比有明显升高,给予DHPG可以上调M1型小胶质细胞的NO产量,与对照组相比有统计学差异。DHPG激活的M1型小胶质细胞上清液倾向于降低神经细胞i NOS的表达,与对照组相比有统计学差异。M2型小胶质细胞在接受DHPG、LY 354740和L-AP4刺激后对NO产量没有影响,与对照组相比无统计学差异。M2状态的小胶质细胞受DHPG以及L-AP4激活时上清液倾向于减少神经细胞i NOS的产生,与对照组相比有统计学差异。结论:(1)促炎状态下小胶质细胞m Glu R I的激活倾向于通过下调促炎性细胞因子的分泌及上调抑炎性细胞因子的释放抑制现有的炎症。m Glu R III激活可以使促炎状态的小胶质细胞向静息状态转化。而m Glu R III能诱导抑炎状态的小胶质细胞保持激活状态。(2)m Glu R激动剂在不同状态下调节小胶质细胞的多态性与MAPK-ERK-Gsk3β途径及PI3K-Akt-Gsk3β途径之间的拮抗关系密切相关。(3)促炎状态下m Glu R I激活与抑炎状态下m Glu R III激活的小胶质细胞上清液会对神经元具有增加细胞活力、减少细胞死亡与损伤,减少兴奋性氨基酸释放以及兴奋性相关通路蛋白表达下调等作用,从而起到潜在的抗癫痫及神经保护作用。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R742.1
【部分图文】：

小胶质细胞是一类可塑性非常高的细胞,可以表现出多种细胞形态并表达不同的细胞表面标志物。小胶质细胞活化后可以大致分为三型:经典活化型M1,选择活化型M2以及M3—获得性失活状态[23,24]。M1型小胶质细胞由脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、细胞或细菌碎片、微生物或干扰素γ(interferon-γ,IFN-γ)刺激后活化形成。激活后,M1型小胶质细胞表达多种促炎性因子/表面标志物如白细胞介素-1β(interleukin,IL-1β),IL-6,IL-12,IL-23,Toll样受体2(Toll-like receptor 2,TLR2),TLR4,趋化因子,肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor alpha,TNF-α),谷氨酸和一氧化氮(nitric oxide,NO)等,还可以在细胞表面表达清道夫受体、主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)II类分子和共刺激因子等,具有促炎性作用[23,25,26]。当小胶质细胞受到细菌、病毒或真菌等刺激时,从静息状态转化而来的M1型可以杀灭外源性病原体并清除相应的细胞碎片等感染物质,募集并促进T细胞的分化,从而启动免疫反应[25,27]。M2型小胶质细胞则表达抑炎性因子/表面标志物,包括IL-10,IL-13,转化生长因子β(transforming growth factorβ,TGF-β),血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),内皮生长因子(endothelial growth factor,EGF),精氨酸1(arginase 1,Arg-1)等,起到对炎症反应的限制并重新建立环境的稳态[28]。最近的研究表明M2型小胶质细胞也可能包含更多可以细分的表型变异,包括M2a、M2b、M2c、M2d等。正常情况下,M1和M2处于动态平衡的状态,但在病理状态下,这种平衡将会被打破。而在特定的情况下,不同激活状态的小胶质细胞之间也可以相互转化。例如,当M1受到IL-13,IL-10,TGF-β等因素刺激时可以向M2型小胶质细胞转化。事实上,很多研究已经证明小胶质细胞的激活是具有高度复杂性和动态性的,也有观点认为小胶质细胞的激活状态在M1和M2表型中具有一定的变化范围,而小胶质细胞最终会分化成为哪一表型取决于它落在该范围的某处以及其遇到的特定的刺激信号[29-33]。静息状态的小胶质细胞受到刺激后分化为不同的表型之间的关系见图1.1。1.1.3 小胶质细胞的谷氨酸受体

mGluR III:小胶质细胞表面的III组谷氨酸受体可以起到保护神经细胞并且对抗小胶质细胞的神经毒性的作用。静息状态的小胶质细胞mGluR III的激活可以与其他细胞对腺苷酸环化酶(adenylate cyclase,AC)的抑制起到协同作用,并抑制毛喉素诱导的环磷酸腺苷(Adenosine 3",5"-cyclic monophosphate,c AMP)累积的作用。当受到LPS或嗜铬粒蛋白A(chromogranin A,CGA)的刺激后,mGluR III的激活可以诱导小胶质细胞的活化,同时引起TNF-α,MHC II和一氧化氮合酶(Nitric oxide synthases)的表达,以及通过NO诱导的减少细胞膜表面的磷脂酰丝氨酸的外化来减少神经细胞程序性死亡。mGluR III的激活还可以抑制小胶质细胞和神经细胞谷氨酸的释放,同时促进星形胶质细胞对于谷氨酸的摄取,还可以降低小胶质细胞的免疫反应性控制神经炎症反应。总而言之,mGluR III的激活可以起到相对直接的神经保护作用[36,51]。小胶质细胞一些代表性谷氨酸受体激活后的下游通路事件见图1.2。1.2 小胶质细胞介导的免疫与炎症反应与癫痫之间的联系

(7)6小时后在显微镜下观察细胞生长状态,若细胞状态良好,则可分别收集各组细胞及上清液,于-20℃短期保存备用。2.2.7 流式细胞术鉴定不同状态的小胶质细胞表型
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