第一部分川崎病B10细胞数量及功能的研究背景:川崎病(KD)是一种儿童急性系统性血管炎症,已发现单核细胞过度活化是其发病的重要环节,但具体机制尚未完全阐明。调节性B细胞(Bregs)是一类不依赖分泌免疫球蛋白且具有免疫调节功能的B细胞,IL-10对于其发挥负性调节作用必不可少,故以功能命名为“B10”细胞。研究已发现B10细胞在多种疾病发病机制中扮演重要角色,但在川崎病中的作用却尚未完全阐明。目的:本研究通过检测KD患者急性和缓解期B细胞不同亚群IL-10表达,分析疾病不同阶段B细胞分化为B10的能力,并进一步评估B10细胞对单核细胞功能的抑制作用,旨在探索川崎病负调控异常的原因,初步阐明单核细胞过度活化的发病机制。方法:选取深圳市儿童医院住院KD患儿23例,根据有无冠状动脉损害分为有冠状动脉损害组(KD~(CAL+))和无冠状动脉损害组(KD~(CAL-))。同年龄健康儿童33例为对照组(Ctrl)。流式细胞术检测外周血总B细胞(CD19~+)、过渡B细胞(CD19~+CD24~hii CD38~(hi))、初始B细胞(CD19~+CD27~-CD24~(int)CD38~(int))和记忆B细胞(CD19~+CD24~(hi)CD27~+)胞内IL-10表达水平。免疫磁珠阴性分选CD19~+B细胞及CD14~+单核细胞。Real-time PCR检测B细胞IL-10 mRNA表达。CpG和sCD40L体外诱导B细胞IL-10表达,再与单核吞噬细胞共培养,流式检测CD14~+单核细胞胞内TNF-α表达水平。通过公式[1-(共培养体系中单核细胞胞内TNF-α表达/单独培养单核细胞内TNF-α表达)×100)]计算抑制率。采用IBM SPSS version 20.0 Windows软件进行统计分析。使用Kolmogorov-Simonov检验来评估数据的正态分布。组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析。P0.05为差异有统计学意义。结果:(1)KD患儿23例,男13例,女10例;年龄6-107月,平均(39.43±25.38)月。KD~(CAL+)13例(56.5%),KD~(CAL-)10例(43.5%),临床表现主要包括:发热持续时间7.48±1.93(5–13)天,皮疹(95.7%),淋巴结肿大(87.0%),结膜充血(100.0%),口唇粘膜病变(100.0%),关节炎(13.0%),手足脱皮(69.6%),脓尿(43.5%),黄疸(13.0%)及血小板增高(82.6%)。(2)四组B细胞群体均表达IL-10;过渡性和记忆性B细胞产生IL-10水平高于初始B细胞。(3)KD急性期,各B细胞亚群IL-10表达均呈下降趋势,记忆B细胞中尤为明显(P0.05)。IVIG治疗后,各B细胞亚群IL-10表达部分恢复;其中总B细胞IL-10表达差异有统计学意义(P0.05)。(4)与Ctrl和KD~(CAL-)组相比,KD~(CAL+)组IL-10表达降低更为明显。(5)与Ctrl相比,KD急性期B细胞IL-10mRNA表达水平明显下降(P0.05);IVIG治疗后,其表达水平较急性期部分恢复(P=0.061)。(6)KD组患儿外周血单核细胞胞内TNF-α表达明显高于Ctrl(P0.05);比较自体诱导B10细胞对单核细胞胞内TNF-α表达的抑制率,KD组较Ctrl组降低四倍(P0.05)。(7)分别将KD组及Ctrl组诱导B10细胞与正常儿童单核细胞进行混合培养,与Ctrl组B10细胞混合培养的单核细胞胞内TNF-α水平较与KD组混合培养的单核细胞明显降低(P0.05)。结论:(1)不同分化阶段B细胞均有分泌IL-10的潜力,这种能力随疾病状态而改变;(2)以单一分化阶段B细胞代表调节性B细胞并不恰当,而以IL-10等功能因子界定B细胞的免疫调节功能更为合适。(3)KD患儿急性期B10细胞数量及功能均受损,其负调节能力下降。第二部分川崎病B10细胞micro RNA调控机制研究背景:IL-10是一种关键负性调节细胞因子,来自多种不同细胞类型,对其表达调控一直是研究重点。最近研究表明,IL-10和mi RNAs之间存在重要相互作用。mi RNAs调控IL-10已被证实在自身免疫和炎症性疾病中发挥重要作用。但以上研究大多基于单核吞噬细胞和T细胞,对于B细胞IL-10表达的mi RNAs调控却尚乏系统研究。目的:本项目利用具有高炎症反应特点的KD疾病模型,对B10细胞mi RNAs调控机制进行系统研究,深入解析该疾病B10细胞负调控异常的原因及其与单核细胞过度炎症反应的关系,为阐明川崎病发病机制提供新的理论基础,以及疾病早期干预筛选新的治疗靶点。方法:免疫磁珠阴性分选CD19+B细胞及CD14+单核细胞。流式检测单核细胞胞内TNF-α蛋白表达水平。Real-time PCR检测B细胞miRNAs表达,包括:mi R-21-3p,mi R-98-5p/3p,mi R-27a-3p,let7b-5p和mi R-142-3p/5p表达。通过多变量分析,确定IL-10表达(因变量)与mi RNAs表达(自变量)之间的关系。通过计算Pearsons(正态数据分布)或Spearmans(非正态数据分布)相关系数,初步探讨IL-10与mi RNAs之间可能的联系。采用多元线性回归分析筛选影响IL-10表达的关键mi RNA。应用多元逐步回归分析确定最佳回归方程(纳入标准P0.05;排除标准P0.1)。利用RNA递载材料PEI将Agomir-27-3p-FAM(Mimic)或Antagomir-27-3p-FAM(Inhibitor),及其相应阴性对照(NC)转染至外周血B细胞。激光共聚焦显微镜检测荧光标记mi RNAs细胞内定位,流式检测转染效率及胞内IL-10表达。采用Cp G+s CD40L诱导培养B10细胞。ELISA检测诱导B10细胞培养上清IL-10表达。将转染及诱导B10细胞与CD14+单核细胞共培养,观察转染后B10细胞对单核细胞TNF-α产生的抑制作用。流式检测单核细胞胞内IL-10表达及Real-time PCR检测单核细胞mi R-27a-3p表达。结果:(1)KD急性期mi R-98-5p/3p、mi R-21-5p、let7b-5p、mi R-27a-3p表达均明显高于对照组;IVIG治疗后,除let7b-5p外,其余mi RNAs表达均下调(P0.05)。KDCAL+组mi R-98-5p、mi R-27a-3p表达增加更显著,而KDCAL-组mi R-21-5p、mi R-98-3p表达增加更显著(P0.05)。mi R-142-3p/5p在KD急性期表达水平较对照组降低(P0.05)。mi R-106a表达水平无明显变化。(2)选取疾病不同阶段表达变化差异显著的micro RNAs作为自变量(mi R-21-3p,mi R-98-5p/3p,mi R-27a-3p,let7b-5p,mi R-142-3p/5p),IL-10作为因变量。多因素分析结果显示:IL-10 m RNA及蛋白表达都与mi R-27a-3p表达呈负相关(r=-0.599,P0.05;r=-0.667,P0.05),但IL-10与其他mi RNAs之间无显著相关关系。多元逐步回归方程为IL-10=0.001-0.001×mi R-27a-3p(根据m RNA水平);IL-10=1.508-0.999×mi R-27a-3p(根据蛋白水平)。(3)激光共聚焦显微镜下观察转染B细胞,荧光主要分布在细胞质中。流式检测显示B细胞的mi RNA转染率可达到(12.42%±0.94%)。(4)转染KD患儿纯化B细胞24h后,Antagomir-27a组B细胞IL-10表达显著高于NC组(P0.05)。(5)转染正常儿童B细胞24h后,流式及ELISA检测Agomir-27a组和Antagomir-27a组B细胞胞内及培养上清IL-10表达水平,均较各自NC组明显降低或升高(P0.05)。(6)与Agomir-27a-B10细胞组共培养的CD14+单核细胞TNF-α表达明显高于与Antagomir-27a-B10细胞组共培养的单核细胞(P0.05)。(7)正常健康儿童外周血单核细胞与KD组或Ctrl组Antagomir-27a-B10细胞共培养,二者混合培养上清IL-10浓度均较各自NC组显著升高,而单核细胞TNF-α表达均下降(P0.05)。(8)KD急性期CD14+单核细胞IL-10表达水平高于Ctrl组;KD单核细胞mi R-27a-3p m RNA表达水平在急性期也明显高于Ctrl组,IVIG治疗后表达下降。结论:KD急性期B细胞mi R-27a-3p表达上调,可通过抑制B10细胞的负调节功能促进单核细胞介导的炎症反应,参与KD发病。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R725.4
【部分图文】：
根据既往文献报道[32],本研究通过使用4个膜表面标记物(CD19、CD38、CD24和CD27)来识别不同的B细胞亚群,包括总B细胞(CD19+)、过渡B细胞(CD19+CD24hiCD38hi)、初始B细胞(CD19+CD27-CD24intCD38int)和记忆B细胞(CD19+CD24hiCD27+)(图1-1)。细胞活性分析表明,每个B细胞亚群中存活B细胞的百分比均大于95%(图1-2)。图1-2流式细胞术检测B细胞及其亚群细胞活力。
流式细胞术检测B细胞及其亚群细胞活力。
经流式检测发现,所有B细胞亚群均产生IL-10;但无论在正常情况,还是疾病状态,过渡性和记忆性B细胞产生的IL-10水平均高于初始B细胞。在KD急性期,各B细胞亚群IL-10表达均呈下降趋势,在记忆B细胞中尤为明显。IVIG治疗后,所有B细胞亚群IL-10表达均增加,但尚未恢复至正常水平;IL-10表达水平在CD19+B细胞(总B细胞)的增加有统计学意义(P<0.05)(图1-3,图1-4A)。结果还发现:与健康对照组和KDCAL-组相比,KDCAL+组IL-10表达降低更为明显(图1-4B),提示疾病病变程度越重,B细胞IL-10的表达水平越低;。图1-4 B细胞及其亚群IL-10表达统计图。
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本文编号：
2875630
