HO-1通过诱导线粒体途径的自噬来抑制人髓核细胞衰老和退变

发布时间：2020-11-11 15:12

　　 椎间盘退变(intervertebral disc degeneration,IVDD)是一种与年龄有关的退行性疾病。IVDD严重影响了患者的生活水平,增加了社会的经济负担。椎间盘主要是由髓核(nucleus pulposus,NP)、纤维环(annulus fibrosus,AF)和软骨终板(Cartilage endplate,CEP)三部分组成。椎间盘退变(IVDD)与髓核细胞的衰老密切相关,随着NP细胞衰老程度的增加,细胞中受损线粒体的积累增多,同时NP细胞数量减少,导致细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)合成能力下降,炎症因子分泌增多,最终导致细胞变性以及死亡。血红素加氧酶(Heme Oxygenase,HO)-1是血红素降解的限速酶,具有抗氧化、抗炎、抗凋亡、抗衰老的作用,在许多疾病中已被证实具有保护或延缓疾病进展的作用。我们之前的研究已经证实HO-1可以抑制椎间盘髓核细胞的凋亡。然而,HO-1在NP细胞衰老和自噬中的作用尚不清楚。因此本课题拟从HO-1和细胞衰老表型在人椎间盘髓核细胞中的表达;HO-1通过促进线粒体途径的自噬抑制髓核细胞的衰老;HO-1诱导的自噬抑制髓核细胞的退变这三个方面分别进行阐述。第一部分:HO-1和细胞衰老表型在人椎间盘髓核细胞中的表达目的:探讨在人椎间盘髓核细胞中HO-1与细胞衰老之间的相互作用关系。方法:获取来自于正常和退变的人椎间盘髓核组织,进行western blot实验和免疫组化观察H0-1和细胞衰老表型的表达情况。体外培养退变的人椎间盘髓核细胞,取髓核细胞的P1,P3,P6代进行实验,采用细胞免疫荧光和western blot检测各代髓核细胞HO-1和细胞衰老蛋白p16及p21的表达情况。采用SA-β-gal染色检测髓核细胞衰老的情况。结果:人椎间盘髓核组织免疫组化显示,与正常组相比,退变组HO-1阳性细胞数量明显减少,而退变组p21、p16阳性细胞数量明显多于正常组(P0.05)。人髓核组织western blot结果显示,退变组HO-1表达降低,p16、p21表达升高(P0.05)。髓核细胞的免疫荧光和western blot实验表明随着髓核细胞连续传代,HO-1的表达水平降低,但是SA-β-gal染色水平和p16和p21表达水平却明显增加(P0.05)。结论:随着椎间盘的退变,髓核细胞衰老增加,而HO-1的表达却降低。第二部分:HO-1通过促进线粒体途径的自噬抑制髓核细胞的衰老目的:探讨HO-1在髓核细胞衰老过程中的相关作用及其具体分子机制作用研究。方法:采用慢病毒过表达HO-1转染髓核细胞,采用流式细胞周期检测、SA-β-gal染色和western blot实验检测不同处理组髓核细胞衰老的表达情况。采用透射电镜、GFP-LC3腺病毒转染和Mito-Tracker共转染和western blot实验检测髓核细胞自噬的水平。采用JC-1染色、细胞内ROS染色和透射电镜检测髓核细胞线粒体功能情况。结果:在通过慢病毒转染的过表达HO-1的髓核细胞中,实验检测发现过表达HO-1的髓核细胞周期G1期细胞比例明显较低(P0.05),同时SA-β-gal染色表达水平和衰老相关蛋白p16和p21表达都明显降低(P0.05)。髓核细胞线粒体功能相关检测发现过表达HO-1的髓核细胞相比对照组线粒体膜电位明显上升,且细胞内活性氧ROS的含量明显下降。在电镜观察显示相比对照组,过表达HO-1的髓核细胞较少出现肿胀、嵴缺失的线粒体。以上提示HO-1能够保护衰老髓核细胞线粒体的功能损伤。为进一步研究结果显示过表达HO-1能够明显促进髓核细胞的线粒体自噬,显著提高了LC3-II蛋白表达,而降低了P62表达,且促进Parkin蛋白主要从细胞质转运到线粒体。GFP-LC3和Mito-Tracker共转染激光共聚焦结果进一步证实,过表达HO-1慢病毒转染后细胞内绿色荧光斑点数显著增多,且促进GFP-LC3和Mito-Tracker的共定位区域增加。电镜结果显示过表达HO-1的髓核细胞中具有典型的双膜自噬体,且自噬体中出现碎片化的线粒体的结构。因此,这些结果提示HO-1过表达促进了髓核细胞的线粒体自噬。为进一步了解自噬在HO-1对髓核细胞衰老的作用,采用自噬抑制剂3-MA处理髓核细胞,发现3-MA处理后,髓核细胞的衰老蛋白p16、p21和p53的蛋白水平以及SA-β-gal染色表达水平明显增加,且细胞的线粒体膜电位明显下降。结论:HO-1抑制髓核细胞的衰老,可能是通过促进线粒体途径的自噬。第三部分:HO-1诱导的自噬抑制椎间盘的退变目的:进一步探讨HO-1诱导的自噬对椎间盘退变的影响方法:将实验分为对照组,LV-NC组,LV-HO-1组和LV-HO-1+3-MA组。采用细胞免疫荧光,western blot和PCR检测髓核细胞外基质II型胶原(COL2)和聚蛋白多糖(AGG),同时检测关键ECM代谢酶MMP-3和MMP-13表达.最后采用直接椎间盘穿刺注射的方式将LV-HO-1注入兔IDD动物模型体内,探讨其对延缓椎间盘退变的实际疗效。结果:髓核细胞被转染过表达HO-1慢病毒后,细胞免疫荧光,western blot和RT-PCR实验提示II型胶原(COL2)和聚蛋白多糖(AGG)的表达水平明显增加,而MMP-3和MMP-13表达明显下降。而给予自噬抑制剂3-MA处理后,髓核细胞II型胶原(COL2)和聚蛋白多糖(AGG)的表达水平明显降低,而MMP-3和MMP-13表达明显增加。提示HO-1诱导自噬在椎间盘退变中起保护作用。最后兔椎间盘退变模型体内实验表明,HO-1能够促进髓核细胞的自噬水平,同时缓解椎间盘的衰老,从而抑制椎间盘的退变。结论:HO-1诱导的自噬抑制髓核细胞的退变
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R681.5
【部分图文】：

5.附图自噬是一种广泛存在于真核细胞中特有的,具有高度保守性的一种溶酶体依赖性降解代谢途径,其主要的生理功能是参与受损的或者变性的蛋白质和细胞器清除,可以循环再利用细胞内的大分子物质,并且在调控细胞衰老的各种生理病理过程中也发挥重要的作用,且在维持细胞内环境及自我稳态发挥重要作用[1-6]。自噬的过程主要可以分为4个阶段:(1)隔离膜的产生;(2)自噬泡的延伸与自噬体的形成;(3)自噬溶酶体的形成;(4)自噬溶酶体的降解。然后根据细胞内底物进入溶酶体的方式不同,将自噬分为巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬。我们通常所说的自噬即为巨自噬,而巨自噬根据其降解对象的选择性,又可将其分为非选择性自噬(即一般自噬)和选择性自噬。其中选择性自噬主要包括CVT途径、过氧化物酶体自噬和线粒体自噬等。线粒体自噬是一种选择性自噬,能够清除受损的线粒体,具有维持细胞内环境稳态的重要作用。目前许多的研究报道线粒体功能障碍被认为是细胞衰老的主要因素之一[7,8]。因此我们猜测线粒体自噬可能参与到髓核细胞的衰老的过程中,并且具体机制还不是非常清楚。

HO-1在衰老的髓核细胞中表达下降

HO-1过表达降低了人NP细胞的复制衰老
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本文编号：2879359