Bruton's酪氨酸激酶(Bruton's Tyrosin Kniase,BTK)抑制剂伊布替尼,因其在B细胞淋巴瘤中的显著疗效得到越来越广泛的应用。但因伴随出现房颤(Atrial Fibrillation,AF)甚至室性心律失常(Ventricular arrhythmias,VA)等心脏并发症,伊布替尼的应用也受到了限制。伊布替尼相关的心律失常及其相关机制成为肿瘤心脏病领域的关注热点但少有研究,特别是目前为止尚无关于此现象的电生理机制的探究。有许多关键性问题需要解决和回答:1)伊布替尼引起VA仅在少量病例报道及一项回顾性病例分析中报道,伊布替尼是否增加室性心律失常易感性尚无定论;2)年龄和既往存在心脏疾病是伊布替尼相关房颤的危险因素,伊布替尼相关VA是否与年龄及既往心脏疾病相关需要明确;3)细胞质钙调异常和膜电生理异常时常见的室性心律失常的相关机制,上述指标可以通过光学标测(钙标测和电压标测)进行分析,伊布替尼用药是否会导致相关的电生理异常需要阐明;4)慢性淋巴细胞白血病(Chronic lymphocytic leukemia,CLL)会导致代谢应激状态,代谢应激感受器AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)活化,伊布替尼敏感CLL细胞较伊布替尼抵抗CLL细胞的AMPK活化减少。AMPK活化受抑制在少数研究中被证实与心律失常易感性增加相关。在伊布替尼相关的VA分子机制探究中,应明确VA是否与其相关的代谢应激(AMPK调节)相关。为了回答以上问题,我们开展了如下研究:实验设计分别两部分:1)急性期实验:麻醉下获取青年(年龄:10-14周)和老年(年龄:10-14月)自发高血压大鼠(Spontaneous hypertensive rats,SHR)心脏,通过Langendorff灌流系统主动脉逆行灌注大鼠心脏,在灌注系统中加入伊布替尼(0.1μM)或溶媒(DMSO),药物接触30分钟。在此期间向灌注系统中加入钙和电压敏感荧光染料进行标记染色。通过大鼠心脏“座椅”连接的起搏装置,递增起搏(9.0hz-12.5hz,每0.5hz)SHR心脏30秒,在起搏最后两秒和起搏停止后两秒,同时标测4秒时间内SHR左室心外膜钙动力学及动作电位的变化,通过Matlab(MathWorks)制作的自定义程序,选择并处理来自标测区域的钙瞬变(Calcium transient)指标,动作电位电交替及电交替的空间一致性。VA易感性通过猝发起搏导致心室颤动(Ventricular fibrillation,VF)进行评估。猝发起搏后持续时间≥10秒的室颤发作被认为是成功诱发的室颤。通过Western blot分析(1)钙调相关蛋白:RyR2受体在Ser2814和Ser2808两个位点处的磷酸化;PLB在Thr17和Ser16两个位点的磷酸化;(2)PI3K-Akt通路;(3)AMPK的磷酸化。2)在体实验部分:选择老年Sprague-Dawley(SD)大鼠作为研究对象,选择伊布替尼10mg/kg/d的剂量(相当于临床治疗剂量420mg/d)作为干预剂量。通过两周喂药(对照组(DMSO)和伊布替尼组)和四周喂药,对获取的SD大鼠心脏,进行递增刺激(9.0hz-15.0hz,每0.5hz)30秒,然后进行钙标测(同上),比较对照组和伊布替尼组的以下指标以判断伊布替尼导致VA的动物模型:(1)递增起搏后VA的出现频率和阈值;(2)猝发起搏后VF的时程,成功诱发VF(VF≥10秒)的比率,持续诱发VF(VF≥60秒)的比率。VF持续超过60秒则给予3J电除颤。同时再次分析钙动力学(分析方法同上)。通过Western blot分析(1)钙调相关蛋白:RyR2受体表达,及在Ser2814和Ser2808两个位点处的磷酸化;SERCA2a表达;PLB表达,及在Thr17和Ser16两个位点的磷酸化;(2)PI3K-Akt通路;(3)AMPK的表达及活化。在急性期实验中,我们发现伊布替尼显著增加了老年SHR对VA的易感性(27.5%vs.5.71%(对照组),p=0.015),但在年轻SHR中,这种增加并没有统计学意义(8%vs.0%(对照组),p=0.49)。在老年SHR中,伊布替尼治疗后,钙瞬变持续时间50(Calcium transient duration 50,CaTD50)延长(p=0.007),钙瞬变振幅交替比明显降低(p=0.03),钙振幅达到峰值的时间(Time to peak,TTP)缩短(p0.001),上述指标的变化提示RyR_2受体钙释放速率加快,SERCA2a从细胞浆摄取Ca~(2+)的能力下降。在青年SHR中,两组间钙动力学相关指标没有差异。膜电生理相关指标显示,在老年SHR大鼠中,伊布替尼治疗组左室心外膜动作电位持续时间80(Action potential duration 80,APD_(80))交替(p0.001)和APD交替空间不一致性(p0.001)更明显,这代表着伊布替尼治疗的SHR大鼠会出现左室心外膜除极的空间和时间不一致性增加。但老年SHR大鼠相关的Western blot结果显示,在RyR2受体磷酸化,PLB磷酸化,AMPK激活,PI3K表达,Akt激活上等蛋白表达及激活上,两组并无差异,结合实验设计,考虑与药物接触时间时间较短,同时伊布替尼对RyR2受体,SERCA2a功能的改变并不是通过磷酸化调节的。综上,急性期的研究表明,伊布替尼的应用可增加SHR室性心律失常的可诱发性,尤其是在老年和合并心肌病变的情况下;钙调异常与左室心外膜复极紊乱是伊布替尼所致的VA易感性增加的电生理机制。在在体实验部分,老年SD大鼠10mg/kg/d伊布替尼口服灌胃给药4周可建立伊布替尼导致室性心律失常的动物模型,10mg/kg/d伊布替尼口服灌胃治疗可明显增加递增起搏后VA出现比率(15.38%vs 5.77%,p=0.04);同时,伊布替尼组递增起搏后VA阈值较对照组明显降低(10.7±0.9 hz vs 13.7±0.5 hz,p=0.02)。猝发起搏后,在四周喂药大鼠中,伊布替尼治疗组和对照组相比,延长了猝发起搏后VF总时长(190.3±18.4s vs 82.5±3.9s,p=0.0017);在成功诱发VF上,伊布替尼组增加了成功诱发VF的比例(70%vs60%),但该增加无统计学意义(p=0.48);同时,在持续VF诱发上,伊布替尼组较对照组亦增加诱发成功率(40%vs 10%),且该增加存在统计学差异(p=0.004)。同时,对喂药四周两组大鼠猝发起搏后的VF进行分类,分为无VF,VF自行终止,VF需除颤治疗。猝发起搏后,伊布替尼治疗组与对照组无VF的比例接近(20%vs 15%),但伊布替尼组需除颤的VF较对照组明显升高(40%vs 10%),自行终止VF较对照组明显降低(40%vs75%)。在钙动力学部分,在伊布替尼治疗组中,老年SD的CaTD_(80)延长(p=0.01),钙瞬变振幅交替比降低(p=0.008)和达峰时间缩短(p=0.046),而在CaTD50,CaTD50/CaTD80比率和SCaE中未观察到差异(分别为p=0.76,0.45和0.38)。分子机制显示,与对照组相比,伊布替尼组会降低PI3K110α表达(p=0.01),降低AMPK磷酸化水平(p=0.04),降低Akt磷酸化水平(p=0.05),但对AMPK表达,Akt表达水平在两组间并无统计学差异(p值分别为0.89,0.26)。同样,两组间RyR2受体表达及磷酸化,SERCA2a受体表达及磷酸化均无明显变化。在体部分提供了一种伊布替尼致室性心律失常的动物模型;同时验证了伊布替尼同时影响RyR2肌浆网钙释放功能及SERCA2a钙摄取能力;伊布替尼相关室性心律失常可能与AMPK的激活受抑制及其相关的钙调异常相关。结论:伊布替尼应用可增加室性心律失常的可诱发性,尤其是在老年和合并心肌病变的情况下;钙调异常和膜电生理复极不同步是其重要的电生理机制;伊布替尼相关室性心律失常可能与AMPK的激活受抑制及其相关的钙调异常相关。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R541.7
【部分图文】：
伊布替尼对大鼠心脏的急性作用试验流程
与对照组相比,伊布替尼治疗的老年SHR大鼠在猝发起搏(50Hz,12V,10sec)时成功诱发VF(室颤≥10s)的比例显著增加(27.5%vs.5.7%,p=0.015)。但是,在年轻SHR大鼠中,伊布替尼治疗组相对于对照组在成功VF诱发的升高无统计学差异(8%vs.0%p=0.49)。(见图2)。3.3.3 伊布替尼增加老年SHR大鼠左室除极的空间和时间不一致性
左心室APD80交替的空间差异在图3B和图4B中显示。与对照组相比,伊布替尼增加了老年SHR左心室除极的空间不一致。(p<0.001;图3B)。年轻的SHR的APD80交替空间不一致性在两组之间没有差异。(p=0.55;图4B)图4.青年SHR中APD80交替和APD交替空间的不一致性
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