小胶质细胞TREM2在糖尿病小鼠认知障碍中的作用及机制研究

发布时间：2020-11-12 22:12

　　 目的认知障碍是糖尿病引起中枢神经系统损害的常见表现之一,其发生发展机制尚未完全阐明。流行病学研究表明,2型糖尿病(Type 2diabetes mellitus,T2DM)患者更容易发生阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease,AD),反之亦然。同时,T2DM与AD之间存在许多共同的病理特点,如胰岛素抵抗、氧化应激损伤、线粒体功能障碍、胆固醇代谢异常、炎症因子浸润、淀粉样蛋白异常沉积等。近年来,基于人群的全基因组关联研究(Genome-Wide Association Studies,GWAS)发现小胶质细胞2型髓样细胞触发受体(Triggering receptor expressed on myeloid cells 2,TREM2)错义突变导致小胶质细胞功能异常是AD发生发展的重要机制。然而,小胶质细胞TREM2在糖尿病认知障碍中是否存在重要作用尚无相关研究报道。本课题旨在通过体内、体外实验探讨TREM2对小胶质细胞炎症反应和极化表型的调控作用,及其在糖尿病认知障碍小鼠中的作用及机制。方法体外实验:通过质粒转染BV-2细胞建立TREM2过表达和干扰细胞模型,并通过脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)干预建立炎症刺激细胞模型。细胞模型分为空白对照组(Con)、LPS+vector组、LPS+TREM2-OE组、LPS+TREM2-shRNA组。在mRNA水平,通过实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)检测细胞炎症相关分子mRNA表达水平的变化,以及M1、M2型小胶质细胞标志物的变化;免疫印迹实验(Western blot,WB)检测NF-κB通路相关蛋白表达情况;细胞免疫荧光(Immunofluorescence,IF)双标实验分别检测M1、M2极化表型标志物蛋白水平变化。体内实验:雄性C57BL/6J小鼠予以高脂饮食(High-fat diet,HFD)喂养50周以建立糖尿病认知障碍的动物模型,对照组小鼠则予以普通饮食(Normal chow diet,NCD)喂养。饮食喂养干预38周后,通过脑立体定位注射CD68启动子的TREM2过表达腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)使双侧海马小胶质细胞TREM2过表达。实验小鼠根据注射TREM2过表达病毒(AAV-TREM2)和对照病毒(AAV-con)分为NCD-con组、HFD-con组、HFD-TREM2组。定位注射10周后,通过莫里斯水迷宫(Morris water maze,MWM)、Y迷宫(Y maze)、新事物识别实验(Novel object recognition,NOR)分别评估小鼠学习、空间记忆、识别记忆功能的变化;腹腔葡糖耐量实验(Intraperitoneal glucose tolerance test,ipGTT)明确小鼠葡萄糖代谢改变。高尔基染色(Golgi stain)分析海马CA1区锥体神经元树突分枝结构复杂性、顶树突树突棘密度;透射电镜(Transmission Electron Microscope,TEM)观察突触超微结构;WB检测海马组织突触相关蛋白synaptophysin、PSD95、spinophilin的表达水平。qPCR检测小鼠海马炎症相关因子及M1、M2型小胶质细胞标志物的mRNA表达水平;WB检测海马NF-κB炎症通路激活情况;鼠脑冰冻切片免疫荧光双标分析海马M1、M2型小胶质细胞极化情况,并通过Image J分析小胶质细胞形态明确小胶质细胞炎症激活的水平。结果体外细胞实验表明,BV-2细胞在LPS刺激下TREM2表达水平降低,肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白介素-6(Interleukin-6,IL-6)、诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)的mRNA表达水平增加。LPS+TREM2-OE组,上述促炎因子表达明显下调,同时M2型小胶质细胞标志物精氨酸合酶-1(Arginase-1,Arg-1)、YM1/2明显升高;相反,LPS+TREM-shRNA组,促炎因子表达明显上调,M2型小胶质细胞标志物明显降低。细胞免疫荧光提示TREM2抑制M1型小胶质细胞标志物iNOS蛋白表达水平,增加M2型小胶质细胞标志物CD206蛋白表达水平。同时,TREM2过表达明显抑制了LPS刺激下BV-2细胞NF-κB通路p-p65、p-ikb-α的蛋白表达,而TREM2干扰则相反。动物实验表明,海马过表达TREM2改善了长期HFD诱导的小鼠学习、空间记忆和识别记忆,表现为MWM实验中潜伏期缩短、隐藏平台穿越次数增加、目标象限游泳路程占总游泳路程比值增加,Y迷宫实验中自发交替频率增加,NOR实验中新事物偏好指数增加。长期HFD喂养使小鼠海马神经元树突结构受损,而相对于HFD-con组,HFD-TREM2组小鼠海马CA1区锥体神经元树突结构复杂性和顶树突树突棘密度均增加,突触相关蛋白Synaptophysin、PSD95、Spinophilin表达增加,突触超微结构更加完整。HFD促使小鼠海马小胶质细胞大量激活及炎症反应加剧,与HFD-con组小鼠相比,HFD-TREM2组海马炎症反应改善,IL-1β、TLR-4的mRNA表达水平下降,M2型标志物Arg-1、YM1/2的表达水平升高;同时,p-p65、p-ikb-α表达下降,NF-κB通路的激活受抑制。TREM2过表达使HFD诱导的海马阿米巴样激活态小胶质细胞数量减少,分枝状的静息态小胶质细胞增加,M1型小胶质细胞(iba-1~+/iNOS~+)减少,M2型小胶质细胞(iba-1~+/Arg-1~+)增多。结论海马小胶质细胞TREM2过表达可改善长期HFD诱导的糖尿病认知障碍小鼠海马锥体神经元树突及突触损伤,增加突触相关蛋白表达,并最终改善其认知损害,其机制与TREM2促进小胶质细胞向M2型极化,抑制小胶质细胞激活,抑制NF-κB通路激活和炎症反应有关。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R587.2;R749.1
【部分图文】：

BV-2细胞系是通过癌基因改建原代培养小鼠小胶质细胞而获得的永生细胞系,其形态学、表型及炎症反应等各项功能特点与小鼠原代小胶质细胞相似。为了验证BV-2细胞在炎症刺激下TREM2的变化趋势,以及在胰岛素抵抗状态下,TREM2的表达是否发生改变,我们分别使用LPS刺激的细胞炎症模型和高浓度胰岛素刺激的胰岛素抵抗细胞模型来进行验证。qPCR结果显示,100ng/ml和1000ng/ml的LPS刺激24小时均可引起BV-2细胞TREM2的mRNA表达水平明显下降,且浓度越高,下降越显著(图1.1 A,P<0.05)。随后,我们通过WB检测p-Akt的水平来判断胰岛素抵抗是否发生,与10nM正常浓度胰岛素处理BV-2细胞相比,2μM高浓度胰岛素干预细胞后,其p-Akt/Akt的比值明显降低,提示BV-2细胞出现胰岛素抵抗(图1.1 B,P<0.05)。qPCR结果提示10nM正常浓度胰岛素干预后,TREM2表达无明显改变,而在胰岛素抵抗情况下,TREM2表达下降(图1.1 C,P<0.05)。因此,在上述细胞模型中,我们初步明确,TREM2的m RNA水平在炎症刺激和胰岛素抵抗状态下均下调。2.2 TREM2抑制BV-2细胞的炎症反应及NF-κB通路的激活

为了探讨TREM2是否具有调控BV-2细胞炎症反应的作用,我们通过质粒转染成功建立了TREM2过表达(TREM2-OE)和干扰(TREM2-shRNA)的BV-2细胞模型,质粒转染效率超过90%(图1.2 A-C)。100ng/ml LPS刺激下,BV-2细胞明显增加了TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS的m RNA表达水平,提示炎症反应增加(图1.2 D-G,P<0.05)。TREM2-OE抑制了LPS刺激下TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS的mRNA表达,而TREM2-shRNA则促进了上述炎症因子mRNA的表达(图1.2 D-G,P<0.05)。通过该实验提示TREM2具有抑制BV-2细胞炎症反应的作用。那么,TREM2抑制炎症的作用是通过什么通路来实现的呢?为此,结合文献报道,我们对NF-κB通路的激活进行验证,结果显示TREM2-OE抑制了p65和ikb-α的磷酸化,而TREM2-shRNA则使其磷酸化增加(图1.2 H,P<0.05)。提示,TREM2可通过抑制NF-κB通路的激活,从而改善炎症反应。图1.2 TREM2抑制LPS刺激下BV-2细胞的炎症反应及NF-κB通路的激活。

TREM2抑制LPS刺激下BV-2细胞的炎症反应及NF-κB通路的激活。
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本文编号：2881301