目的:在法医物证学研究中,混合生物检材一直是检验的难点,因为其组成人数和各组成成分比例的不确定性,造成混合斑的解释困难,使得证据不能发挥原本的效力。目前常规检测的生物标记是短串联重复序列(Short tandem repeat,STR),包括常染色体STR和Y染色体STR标记。对于混合斑STR分型结果的解析,也发展了基于峰高、峰面积等似然比法、贝叶斯理论的统计学方法等,但不同的方法解析标准不一样。而且,由于遮盖效应(Masking effect),传统STR标记只能检测出混合比例在1:10以上的混合斑中的次要参与者,如果混合比例在1:10以下,则无法获得次要参与者的分型。近年来,法医学者发展了更多的遗传标记,例如单核苷酸多态性位点(Single nucleotide polymorphism,SNP)、插入缺失位点(insertion-Deletion polymorphism,INDEL/DIP)、微单倍型标记(Microhaplotype),极大的提高鉴定混合斑的灵敏度,但由于SNP、DIP和微单倍型位点由于其多态性较低,目前只能作为补充检测。2013年,Hall D等学者提出了一种联合标记DIP-STR,将DIP位点的高灵敏度和STR基因座的高多态性结合,用于检测不平衡混合斑。Zhang L等学者提出利用扩增阻滞突变系统(Amplification refractory mutation system,ARMS)原理,实现SNP-STR的联合标记检测,并将其应用于不平衡混合斑。综合以上生物标记的优势,我们提出了运用DIP-SNP和DIP-Microhaplotype遗传标记检测不平衡混合斑和降解的不平衡混合斑。建立利用等位基因特异性引物复合扩增技术、SNaPshot微测序技术和毛细管电泳(Capillary electrophoresis,CE)技术的复合体系,并探索了这两类联合遗传标记在不平衡混合斑和降解不平衡混合斑的应用。方法:1、建立基于DIP-SNP遗传标记对不平衡混合斑的分析方法:(1)按照以下标准,在数据库中筛选DIP-SNP遗传标记:1)DIP位点的等位基因长度(插入或者缺失的碱基)介于2bp-10bp之间;2)DIP位点不能位于重复区;3)DIP和SNP位点的杂合度≥0.2;4)DIP和SNP位点距离≤300bp。(2)根据等位基因特异性扩增技术,利用Primer 3软件设计L型、S型上游引物和下游引物。(3)构建L型和S型复合扩增体系。(4)设计单碱基延伸引物,构建SNaPshot微测序体系和电泳检测方法。(5)利用60例山西汉族健康无关个体,调查人群数据。(6)检测复合体系的灵敏度和种属特异性。(7)检测单个基因座对二参与者不平衡混合斑的检测灵敏度和复合体系对二参与者不平衡混合斑的检测灵敏度。2、建立基于DIP-SNP遗传标记对不平衡混合斑和降解不平衡混合斑的分析方法:(1)按照以下标准,在数据库中筛选新的DIP-SNP遗传标记:1)SNP位点位于DIP位点的上下游150bp以内;2)avHET≥0.2;3)DIP-SNP遗传标记位于不同染色体。(2)根据等位基因特异性扩增技术,利用Primer 3软件设计L型、S型上游引物和下游引物。(3)构建L型和S型复合扩增体系。(4)设计单碱基延伸引物,构建SNaPshot微测序体系和电泳检测方法。(5)利用60例山西汉族健康无关个体,调查人群数据。(6)检测复合体系的灵敏度和种属特异性。(7)检测单个基因座对二参与者不平衡混合斑的检测灵敏度和复合体系对二参与者不平衡混合斑、二参与者降解不平衡混合斑的检测灵敏度。3、建立基于DIP-Microhaplotype遗传标记对不平衡混合斑和降解检材的分析方法:(1)按照以下标准,在数据库中筛选DIP-Microhaplotype遗传标记:1)Microhaplotype位点位于DIP位点上游或者下游150bp以内;3)DIP和SNPs的avHET≥0.2;4)DIP-Microhaplotype遗传标记位于不同染色体。(2)根据等位基因特异性扩增技术,利用Primer 3软件设计L型、S型上游引物和下游引物。(3)构建L型和S型复合扩增体系。(4)设计单碱基延伸引物,构建SNaPshot微测序体系和电泳检测方法。(5)利用60例山西汉族健康无关个体,调查人群数据。(6)检测复合体系的灵敏度和种属特异性。(7)评估单个基因座对二参与者不平衡混合斑的检测灵敏度和复合体系对单一降解检材、二参与者不平衡混合斑的检测灵敏度。(8)对10000对二参与者模拟混合斑进行44个基因座的分析。结果:1、我们共建立了2个DIP-SNP体系,分别包含有14个和20个DIP-SNP遗传标记,其中有3个基因座在山西人群中无多态性。其余基因座多态性良好,分布符合Hardy-Weinberg平衡。两个体系的累计个人识别概率分别为0.999882971和0.998363862。对混合斑检测的平均有效性标记值为0.301和0.293。两个复合体系可以检测到1ng以上DNA模板。复合体系在检测二参与者混合斑中的次要参与者时,灵敏度分别为1:50和1:100。单个基因座对二参与者混合斑中的次要参与者进行检测时,灵敏度均为1:1000。2、该10个DIP-Microhaplotype遗传标记在山西汉族人群中多态性良好,分布符合Hardy-Weinberg平衡。该系统的累计个人识别概率为0.998805889。具有种属特异性。DIP-SNP遗传标记的表型个数从2到4个。其中有1个基因座的DIP位点无多态性,其余9个基因座对混合斑检测的平均有效性标记值(Informative marker value,I value)为0.308。使用0.1ngDNA模板即可获得目标峰,但是为了得到更可信的峰,我们推荐使用1-10ngDNA模板。对二参与者混合斑中次要参与者独有的单倍型的检测灵敏度为1:100。单个基因座对二参与者混合斑中次要参与者的检测灵敏度为1:1000。通过对10000对模拟混合斑的44个基因座分析,有效性标记的个数为3-24个,平均为13.5个,有效性标记越多,检测到的次要参与者的单倍型越多,对次要参与者的个人识别力越高。结论:本实验成功构建了2个DIP-SNP复合体系和1个DIP-Microhaplotype复合体系,并验证了其在单一降解检材、不平衡混合斑、降解的不平衡混合斑的应用价值。DIP-SNP和DIP-Microhaplotype两类遗传标记可作为法医DNA混合斑检测时的一种补充工具。未来需要筛选更多这样的遗传标记。
【学位单位】：山西医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2020
【中图分类】：D919.2
【部分图文】：
DIP-SNP的命名原则
其中,L型是指插入型(Long),S型是指缺失型(Short)。L型上游引物中“.”后面的序列即为插入缺失序列,S型上游引物中“.”后为递补上来的碱基。引物设计原理图见图1-2。PCR引物设计参数:
利用DIP-SNP遗传标记进行混合斑中次要参与者的鉴定时,只有当次要参与者拥有了一条或者两条独有的,和主要参与者不同的DIP等位基因时,利用我们设计的等位基因特异性扩增技术,可以将次要参与者特有的单倍型挑选出来。如图1-3所示,在两种情况下,利用DIP-SNP遗传标记可将二参与者混合斑中的次要参与者区分出来。第一,两个参与者的DIP分型为不同的纯合子时(图中黄色方格);第二,次要参与者的DIP分型为杂合子,主要参与者为纯合子时(图中蓝色方格)。其余情况下是不能将二者区分开的。那么一个DIP-SNP遗传标记能作为有效性标记的能力为I=2l2s2+2l3s+2ls3,其中l为DIP位点插入的频率,s为DIP位点缺失的频率[28,29]。我们用I值(Informative value)来评估每个DIP-SNP对二参与者混合斑的鉴别能力。(1)单个基因座对混合斑中次要参与者的检测灵敏度
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本文编号：
2888294
