葡萄膜炎遗传数据库的建立及其应用

发布时间：2020-11-18 10:36

　　 背景:葡萄膜炎是一类常见的免疫性眼病。众所周知,葡萄膜炎可由多种病因引起,包括感染、自身免疫反应、系统性疾病及外伤等,然而该病确切的发病机制尚未明确。越来越多研究证据表明,遗传因素参与了多种葡萄膜炎类型的发病过程。至今为止,已有大量工作投入到了葡萄膜炎的遗传背景研究当中。随着二代测序技术的发展,大量单核苷酸多态性位点(SNP)被报道与不同疾病易感性密切相关。迄今为止,基于已发表的数据,数个与疾病易感性相关的SNP遗传数据库已被成功建立起来,如:针对先兆子痫的PESNPdb数据库(http://bejerano.stanford.edu/pesnpdb)和针对类风湿关节炎的RAvariome数据库(http://hinv.jp/hinv/rav/)。据我们了解,虽然一些现有的遗传数据库可以查询到不同疾病易感性相关SNP位点,如LOVD数据库(LOVD:http://grenada.lumc.nl/LSDB_list/lsdbs and ClinVar http://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar),然而并没有数据库针对葡萄膜炎遗传相关信息(如与葡萄膜炎易感性相关的SNP位点和基因)。因此,目前有必要建立一个针对葡萄膜炎遗传信息的数据库,从而促进葡萄膜炎的遗传机制研究。葡萄膜炎种类多达百余种,其中在我国最常见的两种类型为Vogt-小柳原田综合征(VKH综合征)和Behcet病。VKH综合征主要出现在亚洲,其临床表现主要为两侧肉芽肿性全葡萄膜炎,并伴有脑膜炎、白癜风和耳聋。Behcet病是一类多系统性疾病,多发于在远东和地中海区域,其临床特点表现为口腔溃疡、葡萄膜炎、皮肤溃疡和生殖器溃疡。尽管两种疾病在临床和病因上截然不同,但是其在遗传背景上具有一定的相似性。最近的研究表明,一些疾病相关的SNP能够调控长链非编码RNA(LINCRNA)的表达,从而参与疾病的发病过程。根据所述背景资料,本研究主要针对以下内容进行深入探究:1.建立UVEOGENE葡萄膜炎遗传数据库。2.基于葡萄膜炎遗传数据库,探究葡萄膜炎中的遗传机制。通过对这些内容的研究,能够完善整理出不同类型葡萄膜炎的遗传背景,筛选出其相关SNP位点和基因,并通过这些数据探究遗传因素是如何参与该疾病发生和发展。第一部分UVEOGENE葡萄膜炎遗传数据库的建立目的:为了促进葡萄膜炎中所涉及的遗传机制相关研究,我们旨在建立一个可靠且信息化的葡萄膜炎遗传数据库。方法:1.数据来源:建立纳入文献标准,制定需要统计的遗传数据信息框架。2.鉴别不同类型葡萄膜炎相关SNP位点、相关基因和相关通路及其在这些疾病之间的异同:根据Behcet病,VKH综合征和急性前葡萄膜炎(AAU)相关位点,鉴定这些疾病相关基因。基于这些疾病相关基因,进一步通过KEGG通路分析方法,鉴定这些疾病的相关通路,从而比较这些疾病相关基因和相关通路的异同。3.比较葡萄膜炎与其他免疫疾病遗传背景的异同:与RAvariome数据库的遗传信息资料进行比较,寻找不同类型葡萄膜炎与类风湿关节炎(RA)相关基因和相关通路的异同。结果:我们从PubMed数据库中整理出了289篇英文文献,共统计出了1612条数据结果,覆盖了370种基因、918个SNP位点、14种葡萄膜炎类型和40个人种,并包含了患者和正常对照者的性别,HLA分型和不同临床表现等具体资料,我们将这些数据整理上传至数据库中并命名为“UVEOGENE数据库”。另外,在这些数据中,我整理出了371条阳性结果。基于数据库内详细的SNP数据资料,我们对Behcet病中研究最为广泛的SNP位点“rs1800629”进行了meta分析。并且我们进一步分析了VKH综合征、Behcet病和急性前葡萄膜炎这三种葡萄膜炎类型遗传背景(相关SNP位点、相关基因和相关通路),比较了这些疾病之间及其与类风湿关节炎遗传背景的异同。结论UVEOGENE数据库是一个可靠且信息化的葡萄膜炎遗传数据库,可用来分析不同类型葡萄膜炎之间和其他免疫疾病遗传背景的异同点,为葡萄膜炎遗传机制研究奠定了良好的基础。第二部分应用葡萄膜炎遗传数据库探究葡萄膜炎中的遗传机制目的:根据葡萄膜炎遗传数据库发现,汉族人群中VKH综合征和Behcet病皆与SNP位点rs12569232密切相关,然而其是如何参与两种疾病的发生和发展尚未明了,通过eQTL分析,该位点与LINC00467表达密切相关。本研究目的旨在探究SNP位点rs12569232是否通过调控LINC00467的表达参与了两种疾病的发生和发展。方法:1.通过MassARRAYAssay飞行质谱对VKH综合征、Behcet病患者和正常对照者的SNP位点rs12569232进行基因分型,验证该位点与LINC00467表达和两种疾病易感性的相关性。2.通过real-time PCR检测活动期VKH综合征、Behcet病患者和正常对照者单核细胞和CD4~+T细胞中LINC00467表达水平的变化。并通过荧光探针法定位LINC00467在CD4~+T细胞中表达位置。3.使用携带LINC00467及阴性对照的AAV对正常人患者的CD4~+T细胞进行转导过表达,使用real-time PCR进行验证。通过Cell Counting Kit-8(CCK-8)试验和ELISA试验,检测过表达LINC00467对CD4~+T细胞分泌IFN-γ和IL-17的影响及对细胞活性的影响。4.通过蛋白芯片和starBase 2.0软件预测LINC00467所作用的蛋白,并通过RNA结合蛋白免疫沉淀实验(RIP)进行验证。结果:SNP位点rs12569232 GG基因型和G等位基因频率在VKH综合征和Behcet病患者中相对于正常对照者显著升高。携带SNP位点rs12569232 GG基因型的正常人单核细胞中LINC00467表达相比于其他基因型的正常人表达明显升高。LINC00467在活动期VKH综合征和Behcet病患者中的单核细胞及CD4~+T细胞中表达相较于正常对照者明显升高。过表达LINC00467能够促进CD4~+T细胞的细胞活性,然而并不能促进其分泌IFN-γ和IL-17。通过两种方法检测出LINC00467可与HUR蛋白进行结合,并成功通过RIP的方法进行验证。结论:本研究结果提示,LINC00467表达与VKH综合征和Behcet病密切相关,且该基因受两种疾病相关SNP位点rs12569232的调控。另外,LINC00467可能通过结合HUR蛋白促进CD4~+T细胞的细胞活性从而参与两种疾病的发生和发展。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R773.9;TP311.13
【部分图文】：

UVEOGENE数据库在PubMed数据库中收录了289篇英文文献,时间范围是从2001年1月至2018年3月。从这些研究中我们收集了共1,612条数据,覆盖了40种人群、370个基因、918个SNP和14种具有不同临床特征的葡萄膜炎类型(表1.1.1)。UVEOGENE在线数据库网站可通过不同的搜索引擎(包括Microsoft、Internet Explorer、firefox、Google Chrome和Safari)进行搜索。为方便不同用户可快速搜索到不同葡萄膜炎类型的遗传数据,我们在主页上设置了快速搜索框,也可以通过高级搜索页面中的“基因搜索”、“疾病搜索”和“SNP搜索”进行搜索,同时可满足用户使用不同的组合进行搜索。在SNP信息页面中,用户可以检索到每个SNP的基本信息和与不同葡萄膜炎类型相关详细数据信息(图1.1.1)。另外,用户可以访问不同葡萄膜炎类型的相关信号通路,且我们将葡萄膜炎的相关基因以红色突出在通路的不同位置上。2.2深入研究不同人种中SNP位点rs1800629和Behcet病易感性的关联性

如上所述,UVEOGENE数据库可通过meta分析进一步探究SNP与不同葡萄膜炎类型易感性的相关性。为了举例说明UVEOGENE数据库可用来分析SNP位点与葡萄膜炎易感性的相关性,我们选择了在Behcet病研究当中研究最为广泛的SNP位点“rs1800629”[13-20]。我们的数据库中共有11项研究分析了Behcet病与SNP“rs1800629”的相关性[21-23]。其中3项研究由于缺乏详细的基因型数据或由于HWE检验P值<0.05被排除,其余八项研究符合meta分析的纳入标准,同时加入了我们尚未发表的Behcet病GWAS研究数据进行了meta分析。结果表明这些研究中该位点和Behcet病相关性的数据结果没有存在显著的异质性(Chi2=6.02,P=0.65;I2=0%)。通过比较Behcet病患者和正常对照的等位基因频率和森林图分析后,结果显示SNP位点rs1800629与Behcet病易感性显著相关(A vs G:OR=0.66,95%CI 0.57–0.77,P<10E-05)(表1.1.2)。最后,我们通过贝格漏斗图可以看出meta分析的结果中SNP位点rs1800629和Behcet病之间的相关性在不同研究中不存在发表性偏移,确定了此次meta分析的可靠性(图1.1.2)。2.3 VKH综合征、Behcet综合征和AAU相关基因和通路及其异同

我们进一步探究这三种葡萄膜炎的相关信号通路及其在三者之间的异同。通过KEGG通路分析,我们发现共有76条通路与Behcet病相关、46条通路与VKH综合征相关和51条通路与AAU相关。在这些通路中,有35条通路皆与这三种葡萄膜炎相关(图1.1.4)。图1.1.4 BD、VKH综合征和AAU相关基因和相关通路比较。(A)三种葡萄膜炎特有的和共有的相关基因。(B)三种葡萄膜炎特有的和共有的相关通路。
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本文编号：2888622