基于人参皂苷Rg3与瑞舒伐他汀不同内皮保护机制的二者联用抗动脉粥样硬化作用研究

发布时间：2020-11-21 17:24

　　 动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是导致不稳定冠状动脉综合征和心源性猝死的重要原因之一,流行病学统计结果显示,自2015年以来亚洲众多国家中因脂代谢异常引发AS导致的心血管疾病发病率急剧上升,已成为除传染性疾病外有较高死亡率的疾病。内皮细胞是血管内膜的主要组成细胞,是保护血管的第一道重要屏障,内膜异常是AS典型病理改变,表现为内皮细胞愈合能力降低、抗炎症细胞浸润能力下降以及细胞凋亡等,进而累及血管进一步损伤。人参皂苷Rg3(ginsenoside Rg3,Rg3)是人参的主要活性成分之一,其抗肿瘤和免疫调节等药理作用已经被熟知。随着研究的不断深入,Rg3对心血管系统的保护作用亦被证实,但有关Rg3抗AS作用及相关机制尚未明确。瑞舒伐他汀属他汀类药物,为HMG-Co A还原酶抑制剂,因具有比其他同类药物调节血脂作用更强、半衰期更短以及生物利用度更高等优点而备受青睐,但其抗AS机制及是否与内皮保护作用有关尚需深入研究。本论文基于吉林省科技厅自然科学基金项目:“瑞舒伐他汀对ox-LDL导致内皮细胞内质网应激的干预作用及分子机制研究”(编号:20150101200JC),探讨瑞舒伐他汀在脂代谢异常引发AS中除降脂外的内皮保护作用及机制,同时对比研究Rg3的内皮保护和抗AS作用及机制。并通过体内实验比较瑞舒伐他汀、Rg3或二者联用对ApoE~(-/-)小鼠AS的保护作用,以期为临床不能耐受全剂量他汀类药物或高肝酶活性患者,联合应用瑞舒伐他汀和Rg3治疗,确保更有效的冠状动脉护理提供理论依据。主要研究如下:1.Rg3对ox-LDL诱导内皮细胞功能异常的作用及机制研究为确定Rg3是否对ox-LDL导致内皮细胞异常有改善作用,建立ox-LDL(200μg/mL)诱导的内皮细胞(HUVECs)损伤模型,Rg3(15、30μmol/L)对HUVECs进行预处理,应用划痕实验、单核细胞黏附实验和Western blotting等方法,研究Rg3对ox-LDL诱导HUVECs功能异常的影响。实验结果显示,Rg3可显著对抗ox-LDL导致的HUVECs愈合能力及抗单核细胞黏附功能下降,减少FAK的磷酸化,抑制黏附分子ICAM-1和VCAM-1的表达,抑制基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的表达,表明Rg3可抑制ox-LDL诱导HUVECs功能异常,且与抑制FAK介导的黏附因子表达有关。为阐明Rg3对ox-LDL诱导HUVECs功能异常的作用机制,采用了迁移实验、单核细胞黏附实验、Western blotting、免疫荧光和qPCR等方法和技术,对相关指标进行了检测。实验结果显示,Rg3可显著增强ox-LDL抑制HUVECs的PPARγ表达,抑制损伤的内皮细胞内NF-κB活化后核易位,降低炎症因子MCP-1和IL-6 mRNA水平;给予GW9662(PPARγ特异性抑制剂)对HUVECs进行预处理,可显著抑制Rg3增强HUVECs迁移及抗单核细胞黏附能力的作用,并抑制Rg3下调FAK的磷酸化、黏附因子和基质金属蛋白酶表达、NF-κB活化后核易位以及炎症因子的作用,表明Rg3可能通过上调内皮细胞PPARγ表达发挥抑制ox-LDL诱导HUVECs异常的作用。2.瑞舒伐他汀对ox-LDL诱导内皮细胞凋亡的保护作用及机制研究建立ox-LDL诱导的内皮细胞损伤模型,瑞舒伐他汀(0.01、0.1及1μmol/L)对HUVECs进行预处理,应用试剂盒、MTT、流式细胞术、DAPI染色和Western blotting等技术和方法,探究瑞舒伐他汀的抗AS作用是否与内皮保护及抗内皮凋亡有关。实验结果显示,瑞舒伐他汀可显著增强ox-LDL刺激下HUVECs分泌NO水平降低,降低细胞氧化应激水平,增强HUVECs的PI3K/Akt/eNOS通路活化及Bcl-2/Bax的比率;MTT结果显示,瑞舒伐他汀可抑制ox-LDL诱导的HUVECs生存率下降;流式细胞术检测结果显示,瑞舒伐他汀可显著降低ox-LDL诱导的HUVECs凋亡率升高;DAPI染色结果显示,瑞舒伐他汀可显著抑制ox-LDL诱导的HUVECs细胞核损伤,以上均表明瑞舒伐他汀可以抑制ox-LDL诱导的HUVECs损伤及凋亡。此外,内皮细胞因其含有丰富的内质网,提示其可能对内质网应激异常导致细胞凋亡更为敏感,为阐明瑞舒伐他汀抑制ox-LDL诱导HUVECs凋亡的作用机制,对内质网应激相关通路进行检测,结果显示瑞舒伐他汀显著降低CHOP、sXBP1和Caspase-12mRNA水平,抑制GRP78表达,降低PERK、IRE1α及eIF2α的磷酸化,表明瑞舒伐他汀可能通过抑制内质网应激相关通路来抑制ox-LDL诱导的HUVECs凋亡。3.Rg3与瑞舒伐他汀联合应用对高脂饮食诱导ApoE~(-/-)小鼠动脉粥样硬化作用研究为比较Rg3与瑞舒伐他汀的抗AS作用,探究Rg3与瑞舒伐他汀联用是否可更有效抑制AS发生及发展,本研究采用高脂饲料(含40%脂肪,1.25%胆固醇)饲养ApoE~(-/-)小鼠成功复制动脉粥样硬化模型后,随机分为4组:模型组、Rg3组(Rg3)、瑞舒伐他汀组(RSV)和Rg3与瑞舒伐他汀联用组(Rg3+RSV),以C57BL/6J小鼠保持喂养普通饲料作为正常对照。给药4 w后,检测小鼠血清T-CHO、TG、LDL-C、HDL-C及CRP水平,HE染色和油红O染色观察小鼠主动脉AS斑块情况,MASSON染色检测小鼠主动脉胶原含量,免疫荧光染色检测小鼠主动脉内皮细胞凋亡情况,免疫组织化学染色检测主动脉和斑块巨噬细胞及平滑肌细胞含量,进而统计各组小鼠AS斑块核帽比及易损指数。本研究结果表明,与正常对照组比较,模型组小鼠T-CHO、TG、LDL-C以及CRP水平均显著升高,HDL-C水平显著降低;主动脉内膜及内膜下细胞排列紊乱,大量胞质呈空泡状,且主动脉内膜隆起纤维斑块层,动脉壁炎细胞浸润、泡沫化严重;主动脉内皮细胞凋亡显著增多,动脉壁胶原纤维含量显著减少;主动脉及斑块部位巨噬细胞表达显著增多,平滑肌细胞显著减少,小鼠AS斑块核帽比及易损指数显著升高。首先,与模型组比较,Rg3+RSV组及RSV组均显著降低小鼠血清LDL-C水平,显著抑制小鼠主动脉内皮细胞凋亡,且两组水平无显著差异,同时Rg3+RSV组显著降低小鼠血清T-CHO水平,但较正常仍呈较高水平,RSV组小鼠血清TG水平显著下降,提示瑞舒伐他汀可能发挥主要降低小鼠血清脂蛋白及抗内皮细胞凋亡作用;其次,Rg3+RSV组和Rg3组均显著降低AS小鼠血清中CRP水平,两组无显著差异,提示Rg3可能发挥主要降低小鼠炎症水平作用;另外,Rg3+RSV组和RSV组小鼠主动脉的胶原纤维含量较模型均显著增加,Rg3+RSV组和Rg3组巨噬细胞表达较模型组减少更为显著,而Rg3+RSV组α-SMA阳性表达增多显著,使得Rg3+RSV组AS斑块核帽比及易损指数降低更为显著。综上所述,Rg3可增强血管内皮细胞愈合能力及抵御炎症细胞黏附的能力,降低炎症因子和促AS细胞因子水平,可能与调节PPARγ/FAK信号通路有关,且Rg3可降低AS小鼠炎症水平,降低主动脉内膜及AS斑块巨噬细胞浸润,表明其可能通过抑制炎症对内皮损伤发挥抗AS作用;瑞舒伐他汀除改善AS小鼠血脂水平外,具有抑制AS小鼠血管内皮细胞凋亡作用,可能与增强血管内皮细胞PI3K/Akt/eNOS通路活化以及抑制内质网应激相关通路有关;另外,Rg3显示出显著抑制ApoE~(-/-)小鼠的AS发生发展的作用,且Rg3与瑞舒伐他汀联用抗AS效果更为显著,提示当临床应用他汀类药物治疗AS效果不理想或对他汀类药物不耐受时,联合应用Rg3可能更有效发挥治疗AS作用。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R965
【文章目录】：
中文摘要
abstract
英文缩写词表
第一章 文献综述
    1.氧化型低密度脂蛋白与动脉粥样硬化
        1.1 氧化型低密度脂蛋白与动脉粥样硬化关系
        1.2 氧化型低密度脂蛋白对血管内皮细胞的影响
            1.2.1 氧化型低密度脂蛋白与内皮功能异常
            1.2.2 氧化型低密度脂蛋白促内质网应激与内皮细胞凋亡
        1.3 氧化型低密度脂蛋白对血管炎症细胞的影响
        1.4 氧化型低密度脂蛋白对血管平滑肌细胞的影响
    2.抗动脉粥样硬化药物研究进展
        2.1 他汀类药物在抗动脉粥样硬化治疗中的应用
        2.2 人参皂苷Rg3抗动脉粥样硬化作用研究进展
        2.3 药物联合应用治疗动脉粥样硬化
第二章 人参皂苷Rg3对ox-LDL诱导内皮功能异常的作用及机制研究
    1.实验材料
        1.1 药品及试剂
        1.2 主要仪器
        1.3 主要溶液及配制
    2.实验方法
        2.1 HUVECs的培养、传代和冻存
        2.2 THP-1的培养、传代和冻存
        2.3 Ox-LDL损伤HUVECs最佳浓度的确定
        2.4 Rg3对HUVECs生存率的影响
        2.5 Rg3对ox-LDL损伤HUVECs生存率的作用
        2.6 划痕实验
        2.7 THP-1细胞黏附实验
        2.8 Transwell实验
        2.9 免疫荧光检测
        2.10 qPCR检测炎症因子表达的影响
        2.11 Western Blot
        2.12 统计学处理
    3.实验结果
        3.1 Ox-LDL损伤HUVECs最佳浓度
        3.2 Rg3对HUVECs生存率的影响
        3.3 Rg3对ox-LDL降低HUVECs细胞生存率的作用
        3.4 Rg3对ox-LDL损伤HUVECs愈合能力的改善作用
        3.5 Rg3对ox-LDL诱导THP-1对HUVECs黏附的抑制作用
        3.6 Rg3对ox-LDL诱导HUVECs黏附分子ICAM-1、VCAM-1表达的影响
        3.7 Rg3对ox-LDL诱导HUVECs FAK磷酸化的影响
        3.8 Rg3对ox-LDL诱导HUVECs内MMP-2及MMP-9表达的影响
        3.9 Rg3对ox-LDL抑制HUVECs PPARγ表达的影响
        3.10 GW9662抑制PPARγ表达的浓度确定
        3.11 GW9662和Rg3对ox-LDL抑制HUVECs PPARγ表达的作用
        3.12 GW9662和Rg3对ox-LDL导致HUVECs迁移抑制、THP-1黏附及相关信号通路的作用
    4.小结
第三章 瑞舒伐他汀对ox-LDL诱导内皮细胞凋亡的保护作用及机制研究
    1.实验材料
        1.1 药品及试剂
        1.2 主要仪器
        1.3 主要溶液配制
    2.实验方法
        2.1 瑞舒伐他汀对HUVECs生存率的影响
        2.2 瑞舒伐他汀对ox-LDL损伤HUVECs生存率的作用
        2.3 试剂盒检测NO和氧化应激水平
        2.4 Annexin V/PI双染检测细胞凋亡
        2.5 DAPI染色
        2.6 qPCR检测
        2.7 Western Blot
        2.8 统计学处理
    3.实验结果
        3.1 瑞舒伐他汀对HUVECs生存率的影响
        3.2 瑞舒伐他汀对ox-LDL导致HUVECs损伤的改善作用
        3.3 瑞舒伐他汀对ox-LDL抑制HUVECs NO分泌的影响
        3.4 瑞舒伐他汀对ox-LDL诱导HUVECs氧化应激的影响
        3.5 瑞舒伐他汀对ox-LDL抑制HUVECse NOS磷酸化的影响
        3.6 瑞舒伐他汀对ox-LDL抑制HUVECs PI3K/Akt磷酸化的影响
        3.7 瑞舒伐他汀对各组细胞Bcl-2/Bax表达的影响
        3.8 瑞舒伐他汀对ox-LDL诱导HUVECs凋亡的影响
        3.9 瑞舒伐他汀对各组HUVECs内CHOP、sXBP1及Caspase-12 mRNA水平的影响
        3.10 瑞舒伐他汀对ox-LDL诱导的HUVECs内质网应激的影响
    4.小结
-/-小鼠动脉粥样硬化作用研究'>第四章 人参皂苷Rg3与瑞舒伐他汀联合应用对高脂饮食诱导的ApoE^-/-小鼠动脉粥样硬化作用研究
    1.实验材料
        1.1 药品及试剂
        1.2 实验仪器
        1.3 主要溶液配制
    2.实验方法
        2.1 实验动物
        2.2 动物的饲养
        2.3 动脉粥样硬化模型复制及给药
        2.4 血脂四项指标检测
        2.5 Elisa试剂盒检测小鼠血清CRP水平
        2.6 小鼠主动脉分离及主动脉大体油红O染色
        2.7 HE及MASSON染色
        2.8 免疫组织化学及免疫荧光染色
        2.9 统计学处理
    3.实验结果
        3.1 药物对AS小鼠体重及一般状态的影响
        3.2 药物对AS斑块水平对影响
        3.3 药物对AS小鼠血清脂蛋白水平的影响
        3.4 药物对AS小鼠血清CRP水平的影响
        3.5 药物对AS小鼠主动脉内皮细胞凋亡的影响
        3.6 药物对AS小鼠主动脉纤维斑块层及胶原纤维水平的影响
        3.7 药物对AS小鼠主动脉CD68及α-SMA表达的影响
    4.小结
第五章 讨论
    1.体外实验研究
        1.1 Rg3对ox-LDL诱导内皮功能异常的作用及机制研究
        1.2 瑞舒伐他汀对ox-LDL诱导内皮细胞凋亡的保护作用及机制研究
    2.体内实验研究
        2.1 Rg3与瑞舒伐他汀联用对AS小鼠血清脂蛋白水平的影响
        2.2 Rg3与瑞舒伐他汀联用对AS小鼠血清CRP水平的影响
-/-小鼠AS病理改变的影响'>        2.3 Rg3与瑞舒伐他汀联用对ApoE^-/-小鼠AS病理改变的影响
结论及创新点
工作展望
参考文献
作者简介及在学期间所取得科研成果
致谢

【参考文献】

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