外泌体miRNA-4448通过下调RRM2基因表达抑制肺癌转移

发布时间：2020-11-22 00:00

　　 目的:肺癌是我国最常见的恶性肿瘤,发病率在我国男性患者中排第一位,在女性患者中排第二位,死亡率高。大部分患者肺癌早期缺乏明显临床体征和有效的早期筛查手段,很多患者确诊时肺癌分期较晚,5年生存率不超过18%。因此,对肺癌机制、早期癌症筛查的生物学标志物及治疗靶点的研究具有重要意义。miRNA是目前肿瘤领域研究最为广泛的非编码RNA,miRNA既通过调节肿瘤细胞的增殖和凋亡影响肿瘤的侵袭和转移,又调控肿瘤细胞免疫逃避过程,还与肿瘤细胞耐药性密切相关。此外,miRNA在肿瘤的早期诊断及筛查、预后及对治疗的反应评价中也具有一定的价值。循环系统中的游离miRNA容易受核糖核酸酶、PH等因素的影响,其理化性质不稳定。外泌体中的miRNA由于受到外膜的保护相对于循环中的游离miRNA,其稳定性优于游离miRNA。近年来越来越多的研究开始关注外泌体miRNA在肺癌发病机制及发展中的重要作用。方法:为了探究外泌体miRNA对非小细胞肺癌的影响,我们使用miRNA微阵列技术对肺癌患者的血液中的外泌体miRNA进行了转录组分析。本研究共纳入6个样本,年龄均在50-60岁之间,其中4例非小细胞肺癌男性患者,包括2例为晚期转移性非小细胞肺癌,2例为早期原发性非小细胞肺癌,另外2例健康男性作为对照组。其后对GSE118370芯片进行数据挖掘,将共同表达的mRNA进行基因本体分析、信号通路分析、cytohubba分析,并应用RNA干扰技术、蛋白电泳技术、细胞增殖和迁移实验验证miRNA/mRNA在肺腺癌中的作用机制。结果:与非转移组相比,miR-4436a和miR-4687-5p是转移组中显著上调的miRNA。在表达下调的差异基因中,转移组中miR-22-3p、miR-3666、miR-4449、miR-4448、miR-6751-5p、miR-92a-3p较非转移组明显表达下调,转移组中miR-3160-5p和miR-4448较健康对照组明显表达下调。miR-22-3p、miR-3666、miR-4449、miR-6751-5p和miR-92a-3p是非转移组与健康对照组相比较,表达上调的差异miRNA。为了进一步评估这些miRNA在非小细胞肺癌中的作用,我们对测序结果和GSE118370进行了整合分析,GSE118370是GEO数据库中的一个微阵列数据集,包括6个肺腺癌组织和6个相邻的正常肺组织。肺腺癌属于非小细胞肺癌。cytohubba分析结果显示,RRM2、AURKA、NEK2、CHEK1、BIRC5、CENPF、MCM10、UBE2D1、CDH1、HMMR等前10位基因为核心发病基因。这些靶基因参与p53信号通路,在肿瘤中发挥重要作用。RRM2位于差异基因的顶端,hsa-miR-3160-5p、hsa-miR-4448、hsa-miR-1254、hsa-miR-4324、hsa-miR-4687-5p和hsa-miR-4436a与RRM2有结合区域。但是,通过与非转移组和对照组相比,只有hsa-miR-4448在转移组呈现差异性下调,故我们锁定miR-4448/RRM2在肺癌中潜在的作用机制作为研究重点。另外在TCGA数据库中,RRM2在肺癌组织中的表达高于正常组织。RRM2的高表达与肺癌的低生存率有关。因此这些miRNA可能参与了非小细胞肺癌的肿瘤发生、增殖、迁移和侵袭。特别是,miR-4448可能以RRM2为靶点,有望成为非小细胞肺癌的生物标志物。综合这些结果,我们认为miR-4448可能通过调控RRM2表达促进非小细胞肺癌的增殖和转移。为了验证我们的结论,我们首先构建了miR-4448过表达和表达下调的A549细胞系。miR-4448过表达后在RNA和蛋白水平使RRM2表达下调,与此结果一致的是,miR-4448表达下调后从RNA和蛋白水平使RRM2表达增加,我们的结果初步说明了miR-4448与RRM2可能存在调控关系。为了进一步验证我们的结论,我们又进行了双荧光素酶报告实验,结果表明了miR-4448可直接特异性结合RRM2的3'UTR并在转录后水平下调RRM2基因的表达。miRNA-4448表达下调后使A549细胞增殖和克隆形成加快,并且出现了更高的侵袭力,这些结果表明:miRNA-4448可通过抑制RRM2的表达抑制肺癌的增殖和转移。肺癌患者中低表达的miRNA-4448可能与肿瘤的恶性程度和不良的预后相关。结论:miR-4448/RRM2调控肺腺癌增殖和转移,可能成为肺腺癌诊断的早期诊疗标志物以及新的药物作用靶点。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R734.2
【部分图文】：

各样本RNA量和质量结果见表3.1,满足测序要求。RNA琼脂糖凝胶电泳结果显示RNA分子量主要分布在28S、18S和5S,RNA完整性满足测序要求(图3.1)。3.1.2.2 外泌体的提取、分离和鉴定

外泌体鉴定

将全部6例样本分别与基因芯片进行杂交,我们对目前已知的1028个基因进行检测,检测芯片图详见图3.3-图3.8。图3.4 GSW(metastasis)芯片杂交图
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本文编号：2893800