白英总碱抗NSCLC的物质基础和作用机制及临床前安全性研究

发布时间：2020-11-23 09:35

　　 非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是人类健康的主要威胁之一,免疫治疗和靶向治疗是近年来NSCLC治疗药物的重要研发方向。肿瘤来源外泌体(Tumor-derived exosomes,TEXs)可促进肿瘤的侵袭、转移、血管新生和免疫逃逸等,也是肿瘤领域的研究热点。TEXs的生物合成和功能发挥与细胞膜脂筏有着紧密的联系。中药白英(Solanum lyratum Thunb.)作为传统抗癌中药,有清热解毒和利湿消肿之效,在临床上被广泛用于治疗各种肿瘤。白英富含多类化学成分,其所含的生物碱组分具有优良的抗肿瘤药效。本课题组前期提取所得的白英总生物碱(total alkaloids from Solanum lvratum,TAS)具有显著的抗NSCLC药效,药理研究表明TAS具有抑制肿瘤血管新生的作用。前期研究阐明了 TAS中含有多种甾体生物碱化合物,并证明了 TAS所含甾体生物碱化合物具有凝集肿瘤血管内皮细胞(tumor-derived vascular endothelial cells,Td-ECs)细胞膜脂筏胆固醇,干扰脂筏形态及功能的作用。本论文的研究目的旨在前期研究的基础上,对TAS的抗肿瘤作用及其物质基础做出进一步的研究,并结合TEXs与细胞膜脂筏间所存在的紧密联系,从体内外两方面研究白英甾体生物碱对TEXs的影响。鉴于皂苷与甾体生物碱类似,均具有与胆固醇结合的性质,和破坏脂筏完整性的活性,我们提出了“甾体糖苷生物碱和皂苷类化合物能够通过破坏细胞膜脂筏结构的完整性影响肿瘤外泌体的生成和功能”的假说。本论文以人参皂苷Rg3为例,对皂苷影响TEXs的生成和功能进行了初步研究,以期对所提假说进行初步验证。此外,本课题组前期以TAS为原料研制了抗肿瘤中药新药安特逍胶囊(antexiao capsule,AtxC),本论文对AtxC的临床前安全性进行了系统的研究,旨在为AtxC的开发应用提供安全性数据。本论文的主要研究方法如下:1.本论文采用多种色谱技术对TAS的化学成分进行了分离纯化,并采用质谱、一维和二维核磁等波谱技术,对分离所得到的单体化合物的结构进行了鉴定。2.为研究TAS及其化学成分的抗肿瘤活性,本论文采用MTT法,检测分离所得到的白英单体化合物1-7、11-13对Td-ECs细胞增殖的影响;采用划痕愈合实验,考察化合物1-7、11-13对Td-ECs细胞血管新生的抑制作用;以鼠源S180肉瘤细胞小鼠移植瘤模型,考察TAS大极性部位(TASG)和小极性部位(TASS)以50、100、200mg·kg-1作为低(L)、中(M)、高(H)剂量组连续灌胃给药10 d对荷瘤小鼠的抑瘤效果,以TAS和环磷酰胺(CTX)作为阳性药,并对荷瘤小鼠的胸腺和脾脏指数进行检测,以ELISA法检测TAS组荷瘤小鼠血清细胞因子IL-6、TGF-β和IFN-y的水平,考察TAS对荷瘤小鼠免疫调节的作用。3.为考察白英生物碱和人参皂苷Rg3对肿瘤的抑制作用是否与TEXs有关,本论文采用外泌体分离试剂盒和超速离心法分离A549细胞来源的外泌体,以Western Blotting法和透射电镜检测,以及纳米粒度分析技术鉴定所分离TEXs;以体外划痕愈合实验、管腔形成实验和Transwell小室侵袭实验,检测A549细胞外泌体对人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)的血管新生的影响;以MTT实验检测了 TAS和白英生物碱SA1及人参皂苷Rg3对A549细胞的增殖抑制作用;以LDH漏出实验检测白英生物碱SAl和人参皂苷Rg3对A549细胞膜完整性的影响;以终浓度为10 μg·mL-1的TAS,终浓度为10 μM的SA1和终浓度为100μM的人参皂苷Rg3干预A549细胞48 h后,检测外泌体粒度,并以分离所得的A549细胞外泌体作用于HUVECs,考察白英生物碱和皂苷干预后的A549细胞所分泌的TEXs对HUVECs血管新生的影响;采用蛋白质组学检测SA1干预与未干预A549细胞及其所分泌的TEXs中的蛋白质组变化;以BALB/c裸鼠构建A549细胞裸鼠移植瘤模型,分别以A549细胞外泌体(Control exosome)和SA1干预的A549细胞所分泌TEXs(SA1 exosome)以100 μg/只剂量,采用瘤内注射方式给予A549荷瘤裸鼠,保持一周2次给药频率,以紫杉醇为阳性药(Taxol,8 mg·kg-1,腹腔注射),并设置溶媒对照组(Model),动态观测肿瘤生长状态,给药时长28 d,实验结束后处死动物,剥取瘤块,称重,计算抑瘤率,考察SA1干预与未干预的A549细胞所分泌的TEXs在体内对肿瘤生长的影响。4.为了考察AtxC的临床前安全性,本论文采用单次灌胃给予小鼠和Beagle犬AtxC内容物,观察其对小鼠的协调运动、自主活动和阈下剂量戊巴比妥钠致催眠作用的影响,及其对Beagle犬心电图指标、血压和呼吸指标的影响;采用单次灌胃给予大鼠和Beagle犬AtxC内容物,观察动物的体重、摄食、心电等指标,考察AtxC的急性毒性反应;采用重复灌胃大鼠26周和Beagle犬39周AtxC内容物,观察动物的体重、心电和临床病理学检查等指标,考察AtxC的长期毒性反应。本论文的主要研究结果如下:1.共分离鉴定出14种甾体糖苷生物碱,其中新化合物12个,分别为:(3β,5α,20S,22S,23R,25S)-16,22-epoxy-23,26-imino-cholestan-3-ylO-β-D-glucopyran osyl-(1→2)-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-galactopyranoside(1),(3β,20S,22S,23R,25S)-16,22-epoxy-23,26-imino-cholestan-5-en-3-ylO-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-galactopyranoside(2),16,23-epoxy-22,26-imino-cholestan-5,22(N),23,25(26)-tetraene-3β-ol-3-0-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-gluc opyranosyl-(1→4)-β-D-galactopyranoside(3),(3β,25R)-16,23-epoxy-23,24-imino-cholestan-5,16,20,23(N)-tetraene-3β-ol-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopy ranosyl-(1→4)-β-D-galactopyranoside(4),(3β,5α,25R)-16,23-epoxy-23,24-imino-cholestan-16,20,23(N)-triene-3β-ol-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyrano syl-(1→4)-β-D-galactopyranoside(5),15β-hydroxyl-(3β,5α,25R)-16,23-epoxy-23,24-imino-cholestan-16,20,23(N)-triene-3β-ol-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→)-β-D-gluco pyranosy l-(1→4)-β-D-galactopyranoside(6),1 5β-hydroxy l-(3β,25β)-16,23-epoxy-23,24-imino-cholestan-5,16,20,23(N)-tetraene-3β-ol-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-galactopyranoside(7),15β-ethoxy-(3β,25R)-16,23-epoxy-23,24-imino-cholestan-5,16,20,23(N)-tetraene-3β-ol-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-galactopyranoside(8),15β-ethoxy-(3β,5α,25R)-16,23-epoxy-23,24-imino-cholestan-16,20,23(N)-triene-3β-ol-3-O-β-D-glucopyr anosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-galactopyranoside(9),15β-hydroxyl-(3β,5α,25R)-16,23-epoxy-23,24-imino-cholestan-16,20,23(N)-triene-3β-ol-3-O-β-D-g lucopyranosyl-(1→4)-β-D-galactopyranoside(10),(3β,1 6R,20R,22α,25R)-spirosolan-5-en-3-ylO-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-O-βD-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-galactopy ranoside(11),(3β,5α,16R,20R,22α,25R)-spirosolan-3-ylO-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-galactopyranoside(12);分离所得两种已知化合物分别为:16,23-epoxy-22,26-imino-cholest-22(N),23,25(26)-trien-3β-ol-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-galactopyranoside(13),(3β,22α,25R)-spirosolan-5-en-3-ylO-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-O-β-D-glucopyranos yl-(1→4)-β-D-galactopyranoside(14,SA1)。2.化合物1-7、11-13以最高100 μM浓度干预Td-ECs细胞48 h时,对细胞的抑制率均未达50%;化合物1-6、11-13作用浓度为25 μM时,可显著抑制Td-ECs细胞的划痕愈合(P0.05),血管内皮细胞生长因子(VEGF)显著促进了 Td-ECs细胞的划痕愈合(P0.05),化合物1-7、11-13均可剂量依赖地抑制VEGF诱导的Td-ECs细胞的划痕愈合能力(P0.05);TASS-L组、TASG-H剂量组和TAS组的抑瘤率较高,分别为39.71%、43.92%和42.13%;与模型组相比,CTX组S180荷瘤小鼠的胸腺和脾脏均指数显著降低(P0.01),白英生物碱各给药组,除大极性高剂量组外,动物的脾脏指数均明显升高,其中TASS-L和TASS-H组动物脾脏指数显著升高(P0.01,P0.05);与CTX组相比,TASS-M、TASS-H和TASG-H组荷瘤小鼠的胸腺指数及白英生物碱各给药组动物的脾脏指数均显著升高;与模型组和CTX组相比,TAS组荷瘤动物血清中的IFN-y水平显著升高(P0.05)。上述结果说明,TAS及其大极性和小极性部位均可抑制小鼠S180移植瘤的生长,且具有提高荷瘤小鼠免疫功能的作用。3.SA1和人参皂苷Rg3虽然对A549细胞的增殖抑制作用弱,但对A549细胞膜完整性具有破坏作用,可剂量依赖地升高A549细胞的LDH漏出率(P0.05);分离所得的A549细胞外泌体呈圆形或椭圆形膜囊泡形态,随着培养时间的延长,细胞所分泌TEXs的直径出现增加,TEXs中标记蛋白CD9、CD63的表达均呈阳性;与空白对照组相比,Control exosome显著促进了 HUVECs细胞的划痕愈合(P0.01);与空白对照组和Control exosome组相比,TAS和SA1干预后A549细胞所分泌TEXs显著抑制了 HUVECs的划痕愈合及A549细胞所分泌TEXs的促HUVECs划痕愈合作用(P0.01),TAS、SA1及Rg3干预后A549细胞所分泌TEXs显著抑制了 HUVECs的管腔形成能力和侵袭能力;药物干预与未干预的A549细胞所产生的TEXs的粒径集中在60-90 nm,TAS、SA1和Rg3干预后A549细胞上清中TEXs浓度较未干预时分别增加了 10、3.8和3.7倍;蛋白质组学结果显示SA1干预与未干预的A549细胞间存在1154个差异蛋白,有Poly(A)RNA结合等功能,参与翻译、rRNA的加工等生物过程,SA1干预与未干预的A549细胞TEXs间存在746个差异蛋白,差异蛋白具有Poly(A)RNA结合、蛋白结合等功能,参与了细胞间粘附、mRNA剪接等生物过程;蛋白质组学所检测差异蛋白共富集到40多种代谢通路,参与500多个信号通路和20多个蛋白-蛋白作用网络,为后续研究提供了多种作用靶点和蛋白通路;与模型组和Control exosome组相比,SA1 exosome对荷瘤动物的肿瘤体积和瘤重均有显著降低作用(P0.01),抑瘤率为70.48%,Control exosome较模型组相比,对肿瘤生长也显示出一定抑制作用。4.单次灌胃给予AtxC除800 mg·kg-1剂量下可增加小鼠戊巴比妥钠阈下剂量入睡率(P0.01)外,对小鼠的自主活动和协调运动均无影响,也不影响Beagle犬的心电、血压、呼吸等指标;AtxC单次灌胃大鼠最大耐受量为4.0 g·kg-1,Beagle犬的最大耐受量大于6.0 g·kg-1,16.0 g·kg-1单次灌胃可致大鼠体重及摄食减少(P0.05);AtxC重复灌胃大鼠的最大耐受量为0.8 g·kg-1,Beagle犬的最大耐受剂量为320 mg·kg-1,AtxC以2.0 g·kg-1剂量重复灌胃大鼠可造成动物胃组织发生病变,AtxC以800 mg·kg-1剂量重复灌胃Beagle犬可显著降低动物体重和血清TP、GLOB 和 ALB 等指标(P0.05)。通过上述研究,本论文得到了以下几点研究结论:(1)本论文从TAS中分离得到12种新甾体糖苷生物碱化合物,证明了分离所得的大多数白英单体生物碱均具有体外抑制肿瘤血管新生的活性,并证明了 TAS有增强S180荷瘤小鼠免疫功能的作用,对TAS的抗肿瘤作用及其物质基础有了进一步的认识;(2)证明了 A549细胞外泌体在体外可促进HUVECs血管新生,而TAS、SA1和Rg3的干预使A549细胞所分泌TEXs有了显著体外血管新生抑制活性,并且可增加TEXs的分泌量,SA1的干预还增加了 A549细胞所分泌TEXs的体内抗肿瘤活性,SA1对TEXs的作用与其能够改变A549细胞及其TEXs的蛋白质组表达有关;(3)初步验证了“甾体糖苷生物碱和皂苷类化合物能够通过破坏细胞膜脂筏结构的完整性影响肿瘤外泌体的生成和功能”的假说,为甾体糖苷生物碱和皂苷类化合物的抗肿瘤研究提供了新的研究思路;(4)证明了以TAS为原料的抗肿瘤中药新药AtxC 口服应用具有良好的安全性。
【学位单位】：中国中医科学院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R285.5
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
英文缩略语
前言
第一章 中药白英的本草考证、物质基础及药用研究进展
    1 本草考证
        1.1 名称考证
        1.2 基原考证
    2 白英的药理作用研究
        2.1 抗肿瘤作用
        2.2 对免疫系统的影响
        2.3 抗菌抗病毒作用
        2.4 其他作用
    3 白英临床应用研究
        3.1 肿瘤
        3.2 其他临床应用
    4 白英药效物质基础研究
        4.1 化学成分研究
        4.2 白英单体成分的活性研究
    5 小结与讨论
第二章 白英总生物碱的化学成分研究
    引言
    1 研究结果
    2 化合物的结构解析
    3 实验部分
        3.1 实验材料
        3.2 主要仪器
    4 本章小结
第三章 白英总碱及其化学成分的抗肿瘤活性研究
    引言
    第一节 白英单体生物碱的体外抗肿瘤活性研究
        1 材料
            1.1 细胞株
            1.2 主要药物及试剂
            1.3 相关溶液的配制
            1.4 主要仪器及耗材
        2 方法
            2.1 细胞培养
            2.2 白英生物碱对Td-ECs细胞增殖的影响
            2.3 白英单体化合物对Td-ECs细胞划痕愈合的影响
            2.4 数据处理
        3 结果
            3.1 白英单体化合物对Td-ECs细胞增殖影响
            3.2 白英单体化合物对Td-ECs细胞划痕愈合的影响
        4 小结与讨论
180小鼠移植瘤的抑制及免疫调节作用'>    第二节 TAS不同极性部位对S₁₈₀小鼠移植瘤的抑制及免疫调节作用
        1 材料
            1.1 细胞株及动物
            1.2 主要药物及试剂
            1.3 相关溶液的配制
        2 方法
            2.1 动物移植瘤模型制备
            2.2 动物分组与给药
            2.3 抑瘤率、胸腺和脾脏指数检测
            2.4 ELISA法检测血清细胞因子水平
            2.5 数据处理
        3 结果
180小鼠移植瘤抑制作用'>            3.1 TAS不同极性部位对S₁₈₀小鼠移植瘤抑制作用
180荷瘤小鼠的免疫调节作用'>            3.2 TAS对S₁₈₀荷瘤小鼠的免疫调节作用
        4 小结与讨论
    本章小结
第四章 白英生物碱及人参皂苷Rg3调控肿瘤外泌体的生成和功能抑制肿瘤血管新生研究
    引言
    1 材料
        1.1 动物及细胞株
        1.2 主要试剂
        1.3 主要仪器
        1.4 主要药物和溶液及其配制
    2 方法
        2.1 细胞培养
        2.2 白英生物碱及人参皂苷Rg3对A549细胞增殖的影响
        2.3 A549细胞LDH漏出检测
        2.4 A549细胞外泌体的提取
        2.5 Western Blotting检测外泌体标记蛋白
        2.6 透射电镜检测外泌体超微结构
        2.7 外泌体粒度检测
        2.8 白英生物碱及人参皂苷Rg3对TEXs体外对血管新生作用的影响
        2.9 蛋白质组学
        2.10 A549细胞裸鼠移植瘤抑制率实验
        2.11 数据处理
    3 结果
        3.1 白英生物碱对A549细胞增殖影响
        3.2 SA1及Rg3对A549细胞LDH漏出量的影响
        3.3 A549细胞外泌体的鉴别
        3.4 A549细胞外泌体对HUVECs血管新生的影响
        3.5 白英生物碱及Rg3对A549细胞外泌体粒度的影响
        3.6 白英生物碱干预后的A549细胞外泌体对HUVECs血管新生的影响
        3.7 白英生物碱SA1对A549细胞外泌体蛋白质组的影响
        3.8 白英生物碱SA1干预后的A549细胞外泌体对A549裸鼠移植瘤的影响
    4 本章小结
第五章 白英总碱（安特逍胶囊）的临床前安全性研究
    引言
    第一节 安特逍胶囊的安全药理学研究
        1 材料
            1.1 动物
            1.2 主要药物及试剂
            1.3 主要仪器
        2 方法
            2.1 小鼠的协调运动和自主活动实验
            2.2 小鼠戊巴比妥钠阈下剂量致催眠作用
            2.3 Beagle犬的心血管系统及呼吸系统功能检测
            2.4 数据处理
        3 结果
            3.1 AtxC对小鼠协调运动的影响
            3.2 AtxC对小鼠自主活动次数的影响
            3.3 AtxC对小鼠戊巴比妥钠阈下剂量的催眠作用影响
            3.4 AtxC对Beagle犬心电、血压及呼吸指标的影响
        4 小结与讨论
    第二节 安特逍胶囊的单次给药毒性研究
        1 材料
            1.1 动物
            1.2 主要药物及试剂
            1.3 主要仪器
        2 方法
            2.1 大鼠急性毒性实验
            2.2 Beagle犬单次给药毒性实验
            2.3 数据处理
        3 结果
            3.1 大鼠单次给药毒性实验结果
            3.2 Beagle犬单次给药毒性实验结果
        4 小结与讨论
    第三节 安特逍胶囊的重复给药毒性研究
        1 材料
            1.1 动物
            1.2 主要药物
            1.3 主要仪器
        2 方法
            2.1 大鼠26周灌胃重复给药毒性实验
            2.2 Beagle犬39周灌胃重复给药毒性实验
            2.3 数据处理
        3 结果
            3.1 AtxC灌胃重复给药26周对大鼠的毒性作用
            3.2 AtxC灌胃重复给药39周对Beagle犬的毒性作用
        4 小结与讨论
    本章小结
第六章 全文总结
    1 总结
    2 展望
    3 创新点
    4 局限性
参考文献
致谢
个人简历
附录
附图
附件

【参考文献】

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本文编号：2894671