HIF-VEGF-Notch通路相关因子在婴幼儿血管瘤组织中的表达和意义

发布时间：2017-04-09 06:24

  本文关键词：HIF-VEGF-Notch通路相关因子在婴幼儿血管瘤组织中的表达和意义，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景和目的婴幼儿血管瘤(Infantile Hemangiomas,IHs)是婴幼儿最常见的血管性良性肿瘤,根据Mulliken等提出的生物学分类法,通过病理学特点、生长方式及临床表现等将其分为血管瘤(Hemangiomas)和血管畸形(Vascular malformations)两大类。其中血管瘤约占先天性血管性病变的80%以上,并且绝大部分婴幼儿血管瘤的生长过程具有典型“分期”特点：病灶大约在出生后即刻或2周内出现,经过平均约10个月左右的快速增殖期后,大概1岁之后进入消退期(持续7-10年)和消退后期。婴幼儿血管瘤的增殖和消退过程与血管内皮细胞的异常增殖和分化、成熟关系密切,因此对婴幼儿血管瘤发病机制及治疗的研究多数集中在影响血管发生和血管生成的诸多因素之中。缺氧诱导因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)是细胞缺氧状态下分泌的最重要细胞因子之一,是肿瘤生长过程中促进新生血管生成的始动因素,HIF-1α的高表达可以对包括血管内皮细胞生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)信号在内的多种下游靶基因进行调控,促进新生血管生成,缓解瘤体细胞供血不足,保证瘤体快速生长。VEGF是参与血管发生和生长的重要因子之一,是血管内皮细胞特异性最高的有丝分裂原。通过与相应血管内皮细胞生长因子受体(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor,VEGFR)结合,激活一系列下游信号,发挥促血管内皮细胞增殖、迁移和增加血管内皮通透性等生物效应,从而促进肿瘤内部新生血管的生成。Notch信号通路是近年来研究较多的参与细胞分化、肿瘤血管形成和生长的热点信号通路之一。其中Notch1受体、Jagged1以及D114均在血管内皮细胞表达并被认为与肿瘤新生血管生成关系最为密切。有研究表明,以上三条信号通路均在实体肿瘤新生血管发生和成熟过程中具有重要作用,对肿瘤的早期生长和血管形成意义重大。但是在婴幼儿血管瘤的发病及疾病进展的不同时期,缺氧、VEGF以及Notch信号通路的相互作用,尤其是Notc h信号通路在婴幼儿血管瘤新生血管生成过程中的意义,目前国内外尚未见明确报道。本文拟通过免疫荧光实时定量PCR(Real-time Quantitative PCR,Q-PCR)对增殖期和消退期婴幼儿血管瘤组织中HIF-VEGF-Notch信号通路相关细胞因子RNA相对表达定量进行检测,并分析各相关因子之间相关性。同时使用免疫组织化学法检测Notch通路因子Notch1、Jaggedl和D114在不同时期婴幼儿血管瘤组织中蛋白表达,并分析其与微血管密度(Microvessel Density,MVD)关系。探寻缺氧、VEGF和Notch信号通路在婴幼儿血管瘤生长过程中表达水平变化及相互影响,对Notch通路在婴幼儿血管瘤增殖和消退过程中对微血管新生的作用及意义进行初步探讨。材料与方法1、收集2012年1月至2013年12月期间在山东省立医院进行手术治疗的27例婴幼儿血管瘤患儿手术切除标本,即刻液氮转运至-80℃冰箱保存。根据Mulliken生物分类法,结合年龄及病理切片HE染色结果,将所有病例分为增生期组(n=15),消退期组(n=12),另取10例患儿瘤旁正常皮肤作为对照组。采用Trizol法提取保存组织中总RNA,经逆转录为cDNA。分别合成HIF-1α、 VEGF、VEGFR2、Notch1、Jaaged1和D114目的基因引物进行Q-PCR检测,使用GFPAH作为内参对照。绘制溶解及扩增曲线结合GAPD H内参表达水平计算相应因子nRNA相对定量。2、收集2009年1月至2013年12月期间在山东省立医院进行手术切除治疗的61例血管瘤患儿所保存病灶组织蜡块,复习资料后将所有病例分为增生期组(n=26),消退期组(n=35)。另取10例患儿瘤旁正常皮肤作为对照组。所有蜡块标本进行切片后以链霉抗生物素-生物素复合物(S-ABC法)进行免疫组织化学染色,以Image-Pro Plus6.0分析软件测量Notch1、Jagged1和D114等蛋白表达的平均光密度值(Optical Density,OD)。以CD34染色标记血管内皮细胞以计算MVD。3、应用SPSS 19.0统计软件包进行处理,对服从正态分布数据采用均数±标准差(x±s)进行表示,不同分组间之间差异比较使用单因素方差分析,相应指标相关性分析用Pearson相关系数检测进行统计学分析。对于偏态分布数据采用中位数(范围)形式表示,组间数据采用Kruskal-Wallis检验分析进行检验和两两比较,利用Spearmann相关检测对不同指标间相关性进行分析。P0.05认为差异具有统计学意义。结果1、由Q-PCR检测计算所得目标因子mRNA相对表达定量进行比较可知,增殖期IHs组织中HIF-1α mRNA显著高于消退期和正常皮肤,消退期与对照组之间差异不显著。增殖期VEGF表达高于消退期及对照组,消退期表达高于正常皮肤,差异均具有统计学意义。增殖期VEGFR2表达高于其他两组,消退期和对照组之间差异不显著。Notch1表达在增殖期和消退期均高于对照组,在增殖期和消退期之间表达水平相近。Jagged1在消退期的表达高于增殖期和对照组,而Dl14在增殖期表达高于消退期和对照组。2、在增殖期IHs组织内,HIF-1 α相对表达水平与VEGF、VEGFR2之间分别呈显著性正向相关(p0.05)。而在消退期,HIF-1α与VEGF关系与增殖期类似,与VEGFR2呈接近正向相关关系。在增殖期IHs组织内,HIF-1α相对表达水平与Notch1、D114之间呈显著性正向相关关系,而消退期未检测到HIF-1 α与Notch通路之间有显著相关。在增殖期,VEGFR2与Notch1存在正向相关关系,同时VEGF与D114之间也存在正向相关。而在消退期,VEGF与D114之间仍存在显著性正向相关关系,其余指标间相关性并不显著。此外,增生期D114分别与Notch1、Jagged1之间呈显著正向相关关系。在消退期Jagged1与Notch1之间接近正向相关,与D114之间相关性不显著。3、通过免疫组织化学染色法测得目的蛋白平均OD值可知,Notch1和DLL4蛋白在增生期及消退期婴幼儿血管瘤组织中的表达均高于正常皮肤,其中D114在增殖期表达水平最高(p0.01),而Notchl在增殖期表达与消退期相仿,差异无统计学意义(p0.05)。Jagged1在增殖期及消退期表达虽然都高于正常皮肤,但在消退期其平均OD值高于增殖期(p0.01)。增殖期血管瘤组织MVD(100.69±22.54)明显高于对照组(43.35±13.08)及正常皮肤对照组(11.67±7.19),差异均具有统计学意义(p0.01)。4、增殖期婴幼儿血管瘤组织中,Notch1、D114平均OD值与MVD之间存在正向相关(p0.05),Jagged1与MVD未检测到显著性相关关系。而在消退期,D114与MVD之间存在正向相关关系(p0.05),而Jagged1与MVD之间接近负向相关关系,Notch1与MVD之间相关性不明显。结论1、不同时期婴幼儿血管瘤组织内缺氧、VEGF与Notch信号通路相关因子存在相互影响,提示HIF-VEGF-Notch信号通路共同参与调节婴幼儿血管瘤的发生和发展。2、增殖期和消退期婴幼儿血管瘤组织内Notch1、Jagged1和Dll4因子的异常活化,提示Notch信号通路在婴幼儿血管瘤增殖和消退过程中均具有重要意义。3、D114信号通路作为缺氧、VEGF下游靶信号在血管瘤的生长和微血管密度的保持过程中具有十分重要的协同作用,而Jagged1蛋白在血管瘤消退过程中可能具有更为重要的作用。对Notch信号通路的干预有望为抑制婴幼儿血管瘤生长和促进其由增殖期向消退期快速转化提供新的治疗思路。
【关键词】：婴幼儿血管瘤 缺氧诱导因子 血管内皮细胞生长因子 Notch信号通路 受体 免疫组织化学 Q-PCR
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R732.2
【目录】：

• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-15
• 符号说明15-16
• 背景及目的16-18
• 实验一18-24
• 材料与方法18-22
• 结果22-24
• 实验二24-28
• 材料与方法24-26
• 结果26-28
• 讨论28-37
• 结论37-38
• 附录38-45
• 参考文献45-51
• 综述51-69
• 参考文献62-69
• 英文文章169-82
• 英文文章282-97
• 致谢97-98
• 攻读学位期间发表的学术论文目录98-100
• 学位论文评阅及答辩情况100

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 郭祯;陈绍林;胡卫彬;;平顶山市婴幼儿血管瘤发病情况调查分析[J];中国实用医药;2012年21期

  本文关键词：HIF-VEGF-Notch通路相关因子在婴幼儿血管瘤组织中的表达和意义，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：294671