p53基因表达及其调控机制的在体研究

发布时间：2017-04-09 14:10

  本文关键词：p53基因表达及其调控机制的在体研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：p53(或称Trp53,肿瘤转化相关蛋白53)是最重要的应激和抑癌因子之一。p53的活性可被两个层次的机制所调控。MDM2和MDMX (MDM4)是最主要的两个p53负向调控因子。去除(释放)MDM2和MDMX抑制效应是翻译后水平的p53活性调控机制的核心,由各种应激信号所诱导的p53、MDM2和MDMX的磷酸化所导致的MDM2和MDMX与p53蛋白不再结合,使得p53蛋白稳定性和转录活性大大增强。p53基因的表达调控是p53调控的另一层次的机制,越来越多的证据提示该调控机制的重要性。p53的转录活性和其剂量直接相关,处于增殖状态的细胞或组织对应激和死亡信号的敏感性增加并且与p53的活性有关。一些细胞实验的结果暗示增殖状态与p53的表达之间也可能存在联系。多种与细胞增殖相关的信号通路均能激活c-MYC,c-MYC属于碱性螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链转录因子家族(basic helix-loop-helix-Leucine zipper,bHLH-LZ),它能结合到E-box (CANNTG)元件上调控多种基因的表达,是细胞生存、增殖、胚胎发育、甚至是促进肿瘤发生、发展所必需的因子。另外,体外的一些数据提示p533'UTR可能在p53表达的转录后水平的调控中起作用。为了方便在广泛的组织中比较精确地研究p53mRNA的表达模式,深入探讨增殖状态与p53表达之间的联系,以及重要顺式元件和相关反式作用因子对p53表达的调控作用,我们首先通过BAC转基因技术成功地构建了四株由不同p53表达调控元件驱动的体内LacZ小鼠报告系统：p53-LacZ (包括p53ZPE、 p53EMZPE、p53ZEP和p53EMZEP小鼠,详细介绍见第二章)。通过分析p53ZPE小鼠(与原位杂交的比对分析证实其LacZ能表征野生型p53的表达)β-gal的活性和模式,我们发现在绝大多数组织,尤其是自我更新旺盛的组织中增殖状态和高水平p53启动子活性之间存在正向的紧密联系,即只有增殖细胞驱动高水平LacZ的表达。我们在p53ZPE小鼠胚胎(10.5天)、幼年的组织(包括p7-8天的小肠、皮肤、骨髓、睾丸、小脑和海马的齿状回等)、自我更新的稳态组织(包括2-3个月的小肠、皮肤、睾丸、骨髓和海马的齿状回等)和小肠息肉中都观察到增殖区域及细胞表达高水平的β-gal,且β-gal蛋白与增殖细胞标记物Ki67共定位。通过比较p7-8天,2-3月和13-15月同种组织中β-gal的表达水平,我们发现很多组织中β-gal表达水平存在随年龄增大而下降的趋势。与组织表达的结果相对应,p53ZPE小鼠胚胎成纤维细胞在血清的刺激下,LacZ和内源性p53 mRNA的表达模式彼此一致,两者的表达都从细胞进入周期开始较弱到细胞进入复制时变强、而在细胞分裂即将结束时又开始下降。通过比较p53ZPE和p53EMZP、p53ZEP和p53EMZEP及p53ZPE和p53ZEP几组小鼠之间LacZ的表达水平,我们进一步确定了小鼠p53启动子上一个保守的E-box序列和p53 3'UTR序列对于胚胎(10.5天)和多种幼年和成年组织(p7-10、2-5月的小肠、皮肤、骨髓、睾丸、肾脏和肝脏等)中β-gal的高表达是必需的。其中,BAC转基因小鼠中E-box的突变(EM)十分显著地下调了LacZ mRNA (Q-PCR)和β-gal (X-gal染色)的表达水平；实验数据还表明该突变对LacZmRNA水平的下调作用在2-5月的成年组织中最明显、其次是p8-10天的幼年组织,影响稍小的是10.5天的胚胎。在小鼠的胚胎(E10.5-E11.5)和成年的快速更新组织(小肠、胰腺)中所进行的ChIP实验的结果表明,E-box突变使c-MYC丧失了结合p53启动子的能力；而通过采用抑制c-MYC-MAX二聚体形成的药物10058-F4处理增殖中的p53ZPE小鼠胚胎成纤维细胞,则明显抑制了c-MYC结合p53启动子的能力并同时显著下调BAC转基因LacZ和内源性p53 mRNA的表达水平。这些数据说明c-MYC在增殖细胞中可通过E-box调控p53的表达,是影响p53表达模式的关键因子。另一方面,p533'UTR的缺失并不显著影响BAC转基因小鼠LacZ mRNA的表达,却大幅下调了β-gal的表达,提示p533'UTR可能通过转录后的翻译调控正向影响基因表达。基于对多种组织中增殖细胞表达高水平p53及其调控模式及元件的认识,我们建立了用于标记和跟踪增殖细胞的可诱导的p53ERT2CreERT2-IRES-EGFP(以下简称p53-EC E)小鼠,并进行了初步的谱系跟踪实验。数据表明,p53-ECE小鼠结合ROSA26报告系统可用于标记和跟踪多种组织中(如小肠、皮肤毛囊、小脑等)的增殖细胞及其衍生细胞：在p6天经Tamoxifen诱导后短时间内(24-36小时)p53-ECE；ROSA26-LSL-LacZ小鼠与p53ZPE报告小鼠有相同的β-gal标记模式,而经Tamoxifen诱导后较长时期后(1-2个月)则可以观察到阳性标记的克隆细胞群。我们的研究首次明确地发现和指出小鼠多种组织的增殖细胞中高表达p53mRNA的模式。另外,p53 3’UTR还可促进其有效的翻译、合成新蛋白。受到MDM2泛素化连接酶等负向因子调控,生理状态下组织和细胞中p53蛋白含量极低,难以用常规方法检测。由于处于增殖期的细胞对肿瘤相关恶性变化易感,我们的发现提示,细胞的增殖状态受到了p53的严格监控,一旦出现应激信号,MDM2和MDMX(MDM4)等负向调控被释放,大量新合成的p53蛋白不再被降解,便可产生快速和强劲的细胞响应,影响和决定细胞的命运。因此,p53基因表达层面的调控是与p53作为快速应激和抑癌因子功能相匹配的重要一环。我们的研究还揭示出c-MYC和p53启动子区域保守的E-box在p53的表达中起到的关键的作用,提示来自增殖细胞的信号反馈至p53,成为预警信号。而且,我们的工作建立了研究体内“静止状态”p53的表达模式和调控机制的体系：p53-LacZ报告系统,以及可用于研究增殖细胞及其衍生细胞的“动态演变过程”的p53-ECE小鼠,将对后续研究产生推动。
【关键词】：p53 表达模式 调控机制 c-MYC E-box p533'UTR BAC转基因 LacZ β-gal ERT2CreERT2 增殖 体内
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730.2
【目录】：

• 摘要7-10
• Abstract10-14
• 主要中英文名词对照表14-15
• 第一章 文献综述15-52
• 1.1 前言15-16
• 1.2 p53的功能-基因组的保护者16-19
• 1.3 细胞增殖状态加强了细胞和机体对应激和死亡信号的灵敏性且该现象与p53的活力直接相关19-23
• 1.3.1 细胞增殖的激发、维持和细胞周期监测点的失调是肿瘤发生和发展的前提19-21
• 1.3.2 细胞增殖信号通路与c-MYC蛋白21-22
• 1.3.3 增殖状态加强了细胞和机体对应激信号和死亡信号的灵敏性且该现象与p53的活力直接相关22-23
• 1.4 p53活力的调控23-35
• 1.4.1 p53蛋白的翻译后调控23-26
• 1.4.2 p53mRNA表达、翻译及其调控的研究现状26-35
• 1.5 BAC转基因技术构建转基因小鼠在研究体内基因的表达及其调控机制和谱系跟踪中的应用35-38
• 1.5.1 应用BAC转基因技术构建报告基因小鼠并用于研究体内基因的表达及其调控机制35-37
• 1.5.2 应用BAC转基因技术构建Cre小鼠并用于谱系跟踪研究37-38
• 1.6 结语38-40
• 参考文献40-52
• 第二章 p53RNA表达及其调控初探和四株BAC转基因p53-LacZ报告小鼠的构建52-78
• 摘要52-53
• 前言53-54
• 材料与方法54-73
• 2.1 利用原位杂交技术观察三种组织中p53 mRNA的表达情况62-64
• 2.2 利用染色体免疫共沉淀技术考察c-MYC结合NIH3T3细胞中p53启动子的情况64-65
• 2.3 利用BAC转基因技术构建四株p53-LacZ报告小鼠65-73
• 2.3.1 构建四种修饰后的p53 BAC66-67
• 2.3.2 鉴定BAC的稳定性和完整性67-68
• 2.3.3 构建转基因小鼠68-69
• 2.3.4 估算各个品系小鼠中转入BAC的拷贝数69-71
• 2.3.5 检测和比较p53 BAC转基因小鼠各株各品系10.5天胚胎的β-gal表达模式和水平71-73
• 2.3.6 检测ZPE小鼠中的β-gal表达水平和模式并与原位杂交的数据相比较73
• 讨论73-75
• 参考文献75-78
• 第三章 在小鼠的多种组织中探讨p53表达的主要模式78-96
• 摘要78-79
• 前言79-81
• 材料与方法81-91
• 3.1 ZPE50 MEF中LacZ和内源性p53 mRNA表达模式相互一致且高水平的β-gal和细胞的增殖状态存在正向相关性84-85
• 3.2 β-gal的表达水平与小鼠皮肤毛囊的增殖状态成正相关85-86
• 3.3 高水平β-gal能在多种组织中与Ki67共定位86-89
• 3.4 多种组织中增殖细胞表达高水平的β-gal且其水平有随年龄增加而下降的趋势89-90
• 3.5 ZPE50;APC~(min)小鼠产生的小肠息肉广泛异位表达高水平β-gal且其表达模式和Ki67一致90-91
• 讨论91-93
• 参考文献93-96
• 第四章 在小鼠多种组织中探讨p53启动子中保守的E-box和p53 3'UTR对p3，UTR对p53表达调控的作用96-117
• 摘要96-97
• 前言97-98
• 材料与方法98-110
• 4.1 p53启动区域E-box突变显著下调了胚胎、幼年期和成年期小鼠多种组织中LacZ mRNA和p-gal的水平101-104
• 4.2 c-MYC在增殖细胞中通过p53启动区域E-box调控p53的表达104-106
• 4.3 去除p53 3'UTR大幅下调了BAC转基因小鼠胚胎、幼年期和成年期多种组织中β-gal的表达水平而不显著影响LacZ mRNA的水平106-110
• 讨论110-113
• 参考文献113-117
• 第五章 建立p53~(ERT2CreERT2-IRES-EGFP)小鼠并结合ROSA26报告系统对多种组织中增殖细胞进行谱系跟踪117-129
• 摘要117-118
• 前言118-119
• 材料与方法119-126
• 5.1 构建p53~(ERT2CreERT2-IRES-EGFP)(简称p53-ECE)小鼠122-124
• 5.1.1 构建p53-ECE BAC122-123
• 5.1.2 构建p53-ECE转基因小鼠123-124
• 5.2 利用p53-ECE;LSL-LacZ小鼠检测Cre的活性及其标记和跟踪增殖细胞的情况124-126
• 讨论126-127
• 参考文献127-129
• 致谢129-130
• Publications130-131

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本文编号：295422