柯萨奇病毒A2病毒样颗粒的制备及小鼠体内保护效力
发布时间：2021-01-25 00:16
手足口病（Hand,Foot and Mouth Disease,HFMD）是主要在夏秋季节流行的病毒性疾病,由多种肠道病毒感染引起,曾经在全世界范围内多次暴发。目前,临床前研发的预防HFMD的主要候选疫苗为细胞基质全病毒灭活疫苗和病毒样颗粒（VLP）疫苗。然而,灭活疫苗中除EV-A71和CV-A16外,其它主要血清型病毒难于在人用疫苗基质细胞中生长。VLP具有产量大、易富集和易纯化的特点,是疫苗发展的主要趋势之一,目前在人用疫苗和兽用疫苗的研究领域都应用广泛。因此研究昆虫细胞杆状病毒Bac-to-Bac表达系统,制备CV-A2 VLPs,具有重要的应用意义。肠道病毒对热极其敏感,温度升高容易诱导病毒粒子衣壳构象改变,从而影响疫苗的免疫原性和保护效力。因此,研发一种具备较好耐热特性的手足口病疫苗,将有效提升手足口疫苗的质量。本论文是由两个部分构成的,主要讨论了利用昆虫杆状病毒表达系统来构建病毒颗粒以及免疫学研究和疫苗候选株热稳定株的筛选及免疫学的初步研究。第一部分:昆虫病毒杆状系统兼有真核表达系统和原核表达系统的优势,最大的优点是,可以产生大量的重组蛋白,另外还可以同时在一个载体上表达...
【文章来源】：武汉生物制品研究所湖北省
【文章页数】：100 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图0红色0-1[31]
粒(V毒难也使表达11.1逆转体系软件全长第二章目前，预VLPs)疫苗难于在人用使得其逐渐达系统，表实验结果目的基因的提取CV-转录成cDN系后，进行将PCR扩件拼接测序长7401nt，武汉章 柯萨预防HFMD。然而，灭疫苗基质细渐广泛应用于表达重组杆状果的获得A2-1580R4NA。以cDN行PCR扩增注：MFig扩增结果送上序结果，获得非编码区汉生物制品研究奇病毒A的主要候选灭活疫苗中细胞中生长于疫苗领域状病毒，纯4/CHNXY/NA为模板，扩增产物：Marker；图2-1CV-g.2-1CV-A2上海生工生得CV-A2-15’-UTR、3究所2020届博382病毒选疫苗为细除EV-A71长。VLP具有域。本研究的纯化获得rCV/2017株基，加入设计物经1%的琼1-5CV-A2部-A2部分序列2partialseque生物工程股份1580R4/CH3’-UTR在基士研究生毕业毒样颗粒的细胞基质全病和CV-A1有产量大、易的目的在于利V-A2VLPs因组，使用计的全基因组琼脂糖电泳部分序列PC列PCR结果encePCRres份有限公司NXY/201基因组的核论文的构建及病毒灭活疫6外，其它易富集和易利用杆状病s(insect)。OligodT/R组测序引物泳检验，见图CR结果sults司测序，利用7株基因组核苷酸位置分及鉴定疫苗和病毒样它主要血清型易纯化的特点病毒Bac-to-Random引物物，配制好扩图2-1。用SeqMan（7组全序列。序分别为1-74样颗型病点，-Bac物，扩增7.1.0）序列47nt
和（K(Pol和31.2Ⅰ/S和3注：F1.31.3.肠杆IPT说明7321-7401X595281.1lyprotein)长3CD序列位重组质粒对重组质SpeⅠ和Xh3CD克隆至a.BamHⅠ/S1:Bamig.2-2IdentCV-A2P1/.1DH10Ba以pFastB杆菌中杆状TG及X-Ga明2个目的武汉nt，其中1），3’-U长度为2191位置，P1：pFastBacD质粒的pFastBhoⅠ/SphⅠ至pFastBacDSpeⅠ酶切后mHⅠ/SpeⅠ酶图2-2：tifiedtargetg/3CD重组cTME.coliBacDual-P1/状病毒的穿梭al的筛选，基因重组到汉生物制品研究中5’-UTRTR后带长1个氨基酸748-3324nDual-P1/3CBacDual-P1双酶切，结Dual质粒中后P1片段;b.酶切后，P1片CV-A2P1(agenesofCV-ABacmid的感受态DN/3CD质粒转梭质粒发生培养48h后到了工程菌究所2020届博39的1-24n长度未确定残基，CV-nt，3CD：5CD的鉴定1片段和pF结果如图2中。XhoⅠ/Sph片段；2:Xhoa)和CV-A2A2P1(a)and的构建A转化转化DH10生同源重组，后可见白色菌里的Bacm士研究生毕业nt极末端序定的多聚A-A2-1580R5383-7317nFastBacDua2-2，片段大Ⅰ酶切后3CDoⅠ/SphⅠ酶23CD(b)基dCV-A23CD0Bac大肠杆经庆大霉色菌落和少许mid质粒内。论文序列为19尾，编码4/CHNXYnt。al-3CD片段大小符合预估Dpian段。M酶切后，3CD因鉴定图D(b)byEnzy杆菌，质粒与霉素、四环素许蓝色菌落。9F引物序码的多聚蛋Y/2017株的段分别用Ba估值，说明：蛋白Mark片段。ymedigestio与DH10Ba素、卡那霉落生长，图序列蛋白的P1amH明P1ker；nac大霉素、2-3。
【参考文献】：
期刊论文
[1]2017年湖北省襄阳市手足口病患者柯萨奇病毒A2型分离株的突变和重组分析[J]. 罗志宇,王泽鋆,孟胜利,禹玉婷,麦健仪,李萌,申硕. 微生物学免疫学进展. 2019(04)
[2]手足口病疫苗研发策略和进展[J]. 毛群颖,吴星,高帆,梁争论,徐苗,王军志. 中国病毒病杂志. 2018(06)
[3]我国手足口病流行及诊治进展十年回首[J]. 钱素云,李兴旺. 中华儿科杂志. 2018 (05)
[4]肠道病毒71型感染手足口病患儿的肠道排毒时间及传播机制的初步探讨[J]. 赵仕勇,林先耀,滕淑,陈晓玲,徐婷,吴亦栋,韦翊. 疾病监测. 2015(01)
[5]柯萨奇病毒A组16型研究新进展[J]. 王慎玉,朱凤才,汪华. 中华疾病控制杂志. 2014(01)
[6]柯萨奇病毒A组2、6、8、12型山东地方株型别鉴定及其基因特征分析[J]. 陈鹏,陶泽新,王海岩,刘尧,宋立志,刘桂芳,纪峰,徐爱强. 病毒学报. 2012(05)
[7]2008年广州地区手足口病的病原学研究[J]. 朱冰,钟家禹,夏慧敏,龚四堂,肖密丝,谢嘉慧,张莹莹,华亮,连广琬. 中华儿科杂志. 2010 (02)
[8]阜阳市手足口病（EV71感染）疫情流行病学分析[J]. 万俊峰,朱理业,刘红,曹明华,丁振涛,见海晖. 安徽医学. 2008(04)
博士论文
[1]大熊猫犬瘟热流行病学调查与实验免疫研究[D]. 冯娜.吉林农业大学 2017
硕士论文
[1]20092011年广州地区儿童手足口病柯萨奇病毒A16型（CA16）流行病学调查及CA16-IgM抗体动态规律分析[D]. 郭敏.南方医科大学 2012
本文编号：2998186
【文章来源】：武汉生物制品研究所湖北省
【文章页数】：100 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图0红色0-1[31]
粒(V毒难也使表达11.1逆转体系软件全长第二章目前，预VLPs)疫苗难于在人用使得其逐渐达系统，表实验结果目的基因的提取CV-转录成cDN系后，进行将PCR扩件拼接测序长7401nt，武汉章 柯萨预防HFMD。然而，灭疫苗基质细渐广泛应用于表达重组杆状果的获得A2-1580R4NA。以cDN行PCR扩增注：MFig扩增结果送上序结果，获得非编码区汉生物制品研究奇病毒A的主要候选灭活疫苗中细胞中生长于疫苗领域状病毒，纯4/CHNXY/NA为模板，扩增产物：Marker；图2-1CV-g.2-1CV-A2上海生工生得CV-A2-15’-UTR、3究所2020届博382病毒选疫苗为细除EV-A71长。VLP具有域。本研究的纯化获得rCV/2017株基，加入设计物经1%的琼1-5CV-A2部-A2部分序列2partialseque生物工程股份1580R4/CH3’-UTR在基士研究生毕业毒样颗粒的细胞基质全病和CV-A1有产量大、易的目的在于利V-A2VLPs因组，使用计的全基因组琼脂糖电泳部分序列PC列PCR结果encePCRres份有限公司NXY/201基因组的核论文的构建及病毒灭活疫6外，其它易富集和易利用杆状病s(insect)。OligodT/R组测序引物泳检验，见图CR结果sults司测序，利用7株基因组核苷酸位置分及鉴定疫苗和病毒样它主要血清型易纯化的特点病毒Bac-to-Random引物物，配制好扩图2-1。用SeqMan（7组全序列。序分别为1-74样颗型病点，-Bac物，扩增7.1.0）序列47nt
和（K(Pol和31.2Ⅰ/S和3注：F1.31.3.肠杆IPT说明7321-7401X595281.1lyprotein)长3CD序列位重组质粒对重组质SpeⅠ和Xh3CD克隆至a.BamHⅠ/S1:Bamig.2-2IdentCV-A2P1/.1DH10Ba以pFastB杆菌中杆状TG及X-Ga明2个目的武汉nt，其中1），3’-U长度为2191位置，P1：pFastBacD质粒的pFastBhoⅠ/SphⅠ至pFastBacDSpeⅠ酶切后mHⅠ/SpeⅠ酶图2-2：tifiedtargetg/3CD重组cTME.coliBacDual-P1/状病毒的穿梭al的筛选，基因重组到汉生物制品研究中5’-UTRTR后带长1个氨基酸748-3324nDual-P1/3CBacDual-P1双酶切，结Dual质粒中后P1片段;b.酶切后，P1片CV-A2P1(agenesofCV-ABacmid的感受态DN/3CD质粒转梭质粒发生培养48h后到了工程菌究所2020届博39的1-24n长度未确定残基，CV-nt，3CD：5CD的鉴定1片段和pF结果如图2中。XhoⅠ/Sph片段；2:Xhoa)和CV-A2A2P1(a)and的构建A转化转化DH10生同源重组，后可见白色菌里的Bacm士研究生毕业nt极末端序定的多聚A-A2-1580R5383-7317nFastBacDua2-2，片段大Ⅰ酶切后3CDoⅠ/SphⅠ酶23CD(b)基dCV-A23CD0Bac大肠杆经庆大霉色菌落和少许mid质粒内。论文序列为19尾，编码4/CHNXYnt。al-3CD片段大小符合预估Dpian段。M酶切后，3CD因鉴定图D(b)byEnzy杆菌，质粒与霉素、四环素许蓝色菌落。9F引物序码的多聚蛋Y/2017株的段分别用Ba估值，说明：蛋白Mark片段。ymedigestio与DH10Ba素、卡那霉落生长，图序列蛋白的P1amH明P1ker；nac大霉素、2-3。
【参考文献】：
期刊论文
[1]2017年湖北省襄阳市手足口病患者柯萨奇病毒A2型分离株的突变和重组分析[J]. 罗志宇,王泽鋆,孟胜利,禹玉婷,麦健仪,李萌,申硕. 微生物学免疫学进展. 2019(04)
[2]手足口病疫苗研发策略和进展[J]. 毛群颖,吴星,高帆,梁争论,徐苗,王军志. 中国病毒病杂志. 2018(06)
[3]我国手足口病流行及诊治进展十年回首[J]. 钱素云,李兴旺. 中华儿科杂志. 2018 (05)
[4]肠道病毒71型感染手足口病患儿的肠道排毒时间及传播机制的初步探讨[J]. 赵仕勇,林先耀,滕淑,陈晓玲,徐婷,吴亦栋,韦翊. 疾病监测. 2015(01)
[5]柯萨奇病毒A组16型研究新进展[J]. 王慎玉,朱凤才,汪华. 中华疾病控制杂志. 2014(01)
[6]柯萨奇病毒A组2、6、8、12型山东地方株型别鉴定及其基因特征分析[J]. 陈鹏,陶泽新,王海岩,刘尧,宋立志,刘桂芳,纪峰,徐爱强. 病毒学报. 2012(05)
[7]2008年广州地区手足口病的病原学研究[J]. 朱冰,钟家禹,夏慧敏,龚四堂,肖密丝,谢嘉慧,张莹莹,华亮,连广琬. 中华儿科杂志. 2010 (02)
[8]阜阳市手足口病（EV71感染）疫情流行病学分析[J]. 万俊峰,朱理业,刘红,曹明华,丁振涛,见海晖. 安徽医学. 2008(04)
博士论文
[1]大熊猫犬瘟热流行病学调查与实验免疫研究[D]. 冯娜.吉林农业大学 2017
硕士论文
[1]20092011年广州地区儿童手足口病柯萨奇病毒A16型（CA16）流行病学调查及CA16-IgM抗体动态规律分析[D]. 郭敏.南方医科大学 2012
本文编号：2998186
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