过表达CREG的骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠心肌梗死的作用及机制研究

发布时间：2017-04-12 01:05

  本文关键词：过表达CREG的骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠心肌梗死的作用及机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：实验背景:心肌梗死(myocardial infarction,MI)是常见的致死性疾病之一,即使患者度过急性期,也可能会由于成体心肌细胞的再生能力不足,使心肌细胞发生不可逆的丢失,进一步坏死心肌组织会被纤维瘢痕组织替代,最终导致心力衰竭的发生。研究发现,应用骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)移植技术治疗MI能够有效防止病理性心室重构,增强心脏收缩功能,促进心功能恢复。BMSCs移植到梗死心肌边缘区后,可通过旁分泌多种生长因子诱导血管新生,从而改善梗死区微环境进而发挥功效。因此,通过人工干预手段提高BMSCs移植后的促血管新生因子旁分泌的作用,始终是心血管病学、组织工程学和再生医学领域的研究热点。E1A激活基因阻遏子(cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG)在成体组织细胞中广泛表达,但是在原始干细胞中几乎不表达。研究发现,在血管内皮细胞中,CREG可促进其分泌血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF);而在胚胎干细胞中,过表达CREG可促进其向内皮细胞定向分化并形成新生血管。我们的前期体外研究也发现,BMSCs过表达CREG后,能够在体外对抗病理条件导致的细胞凋亡。但是,在体情况下,CREG基因修饰的BMSCs对急性MI的治疗作用及机制均不清楚。因此,本研究拟通过动物体内实验阐明过表达CREG后BMSCs治疗MI的效果并探讨其机制,为防治心肌梗死提供新的治疗手段和理论依据。实验目的:1.明确过表达CREG的BMSCs移植对大鼠心肌梗死的治疗作用;2.明确过表达CREG的BMSCs移植是否通过促进旁分泌及血管新生发挥减轻MI损伤的作用;3.明确CREG是否通过上调HIF-1α促进BMSCs的旁分泌作用。实验方法:1.过表达CREG的BMSCs建立:利用表达CREG-GFP和GFP的腺病毒分别感染BMSCs,建立CREG过表达的BMSCs(CREGBMSCs)和感染对照组BMSCs(GFPBMSCs)。通过荧光显微镜观察转染效果,当转染效率达95%以上后,可用于进行干细胞移植。2.大鼠MI模型的制备:利用2%异氟烷挥发性麻药麻醉大鼠并固定于操作台上,经其左侧胸骨的第4、5肋间将心脏暴露,通过结扎大鼠的心脏冠脉左前降支(left anterior desending coronary artery,LAD)建立MI模型;然后在梗死心脏边缘区域进行5个点注射治疗。根据注射成分的不同将大鼠分为4组,分别是注射对照组(PBS组),普通BMSCs(NormBMSCs)治疗组,GFPBMSCs治疗组和CREGBMSCs治疗组。3.干细胞移植治疗MI后的第3天与14天,(1)利用小动物超声测定大鼠心功能;(2)采用Masson染色检测小鼠心肌纤维化程度;(3)利用Western blots方法检测心肌组织中凋亡指标cleaved Caspase-3表达水平;(4)利用ELISA方法检测心肌组织中VEGF的表达水平;(5)通过共聚焦显微镜观察心肌组织中CD31的表达水平;4.体外模拟缺氧环境,通过ELISA方法检测过表达CREG对BMSCs的旁分泌生长因子影响,同时采用Matrigel方法观察其对血管新生的影响。5.通过Western blot方法以及Real-time PCR方法来,探讨体外缺氧条件下CREG调控BMSCs旁分泌的分子机制。实验结果:1.体内部分(1)过表达CREG的BMSCs治疗组(CREGBMSCs)的大鼠第3天与第14天的射血分数(ejection fraction,EF)和短轴缩短率(fractional shortening,FS)比PBS组、NormBMSCs治疗组以及GFPBMSCs治疗组均有明显的改善。这一结果表明,CREG过表达可提高BMSCs移植治疗MI的效果,使心功能得到进一步的改善。(2)CREGBMSCs治疗组的大鼠心脏纤维化面积明显少于PBS组、NormBMSCs治疗组和GFPBMSCs治疗组。这一结果表明,CREG过表达的BMSCs移植治疗可进一步减少心肌纤维化的发生,从而延缓心室重构。(3)无论在3天还是14天时间点,CREGBMSCs治疗组的大鼠心肌凋亡指标cleaved Caspase-3表达水平明显低于其他3组。这一结果表明,CREG过表达BMSCs移植治疗可以进一步减少心肌细胞凋亡的发生。(4)无论在3天还是14天时间点,CREGBMSCs治疗组的大鼠心脏的血管新生都明显多于其他3组。这一结果表明,CREG过表达BMSCs移植治疗可进一步促进血管新生,从而改善梗死区微环境。(5)过表达CREG能够延缓移植后BMSCs的凋亡,同时延长VEGF的旁分泌作用。2.体外部分(1)体外缺氧条件下,CREG过表达可以促进BMSCs分泌VEGF;培养CREGBMSCs的上清液可以促进体外内皮细胞血管网的形成。(2)CREG促进HIF-1α的表达以及核转位。(3)通过HIF-1α的si RNA抑制实验证实,CREG通过调控HIF-1α促进VEGF分泌,进而促进血管新生。(4)过表达CREG降低VHL(降解HIF-1α的主要分子)m RNA合成,继而上调HIF-1α。实验结论:1.过表达CREG的BMSCs移植治疗能够进一步提高BMSCs改善MI心功能,同时减少纤维化和心肌凋亡发生的作用;2.过表达CREG的BMSCs其旁分泌VEGF及促血管新生的作用进一步增强;3.CREG通过减少调控HIF-1α降解的VHL的m RNA合成使HIF-1α表达增加,进而上调VEGF分泌,促进血管新生。
【关键词】：心肌梗死 E1A激活基因阻遏子 骨髓间充质干细胞 缺氧诱导因子-1α VHL
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R542.22
【目录】：

• 缩略语表4-6
• 中文摘要6-9
• ABSTRACT9-13
• 前言13-15
• 文献回顾15-29
• 第一部分 过表达CREG的BMSCS具有减轻MI损伤的作用29-42
• 1 材料29-33
• 2 方法33-35
• 3 结果35-39
• 4 讨论39-42
• 第二部分CREG通过抑制BMSCS凋亡促进旁分泌与血管新生减轻MI损伤42-55
• 1 材料42-46
• 2 方法46-48
• 3 结果48-51
• 4 讨论51-55
• 第三部分CREG通过HIF-1Α/VHL途径促进缺氧条件下BMSCS的VEGF旁分泌55-66
• 1 材料55-57
• 2 方法57-59
• 3 结果59-62
• 4 讨论62-66
• 小结66-67
• 参考文献67-83
• 个人简历和研究成果83-85
• 致谢85

  本文关键词：过表达CREG的骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠心肌梗死的作用及机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：300349