上皮间质转化机制在高氧肺损伤中的调控作用及IGF-1的干预效应

发布时间：2017-04-13 00:23

本文关键词：上皮间质转化机制在高氧肺损伤中的调控作用及IGF-1的干预效应，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：氧疗法是新生儿重症监护中必不可少的一项重要措施,但是氧属于气体药物,也有不良反应。随着新生儿抢救技术的发展和肺表面活性物质的问世,新生儿呼吸窘迫症的死亡率明显下降,但支气管肺发育不良(BPD)的发病率反而逐年增加,严重影响新生儿的存活率及生存质量。BPD其发病机制尚不完全清楚。目前认为BPD其本质是受到呼吸机容量伤、氧毒性、肺水肿、脓毒血症等多种损伤引起大量细胞因子的级联反应和肺损伤,导致发生肺组织异常修复。近年来,有关BPD的防治问题成为研究热点,临床上尚无一疗效肯定的药物用于支气管肺发育不良的预防和治疗。正常肺发育需要间充质细胞和上皮细胞分泌的许多信号分子相互协调作用及其中刺激和抑制因子的相互平衡调节作用。肺发育过程可被划分为五个阶段,包括①胚胎期：前肠腹侧壁形成喉气管憩室,末端膨大形成肺芽,肺芽分支为2个支气管芽,支气管芽延长形成主支气管；②腺样期：支气管树分支形成,但与气体交换有关的组织结构还未形成;③导管期：呼吸性细支气管形成,同时围绕呼吸性细支气管的脏壁中胚层内毛细血管数量增加;④囊泡期：终末囊数量增多,Ⅰ型和H型肺泡上皮细胞开始分化,囊泡壁内含双层毛细血管;⑤肺泡期：通过原始囊泡分割,肺泡快速形成,随后肺泡壁变薄,肺泡隔中的双层毛细血管融合为单层。长时间吸入高氧会引起肺结构和功能的异常,在肺泡形成过程中,肺组织的主要结构细胞相互作用和调控导致了正常肺泡形成或异常的纤维增生。肺纤维化是以正常肺泡上皮细胞增殖修复受抑制,大量成纤维细胞增生、聚集,ECM沉积为特征。近年来,上皮细胞包括肺泡上皮细胞(AECs)在某些病理、生理、环境等因素影响下,可发生表型的改变,进一步表明细胞表型具有可塑性。长期吸入高浓度氧可引起急慢性肺损伤,肺损伤包括肺泡结构破坏、通透性增高及纤维化病变,由于AECII是肺损伤时的关键修复细胞,在致病因素持续的条件下,AECⅡ向AECI转分化受到抑制,肺泡Ⅱ型上皮细胞本身不断增殖,并释放出大量的细胞因子、炎症因子,该过程也可伴随脂成纤维细胞向肌成纤维细胞的转分化,上皮间质转化发生并诱导形成肺纤维化。通过EMT途径由AECs转化而来的成纤维细胞/成肌纤维细胞可能是肺纤维化的重要来源。胰岛素样生长因子-1(insulin-like gowth factor, IGF-1)的功能是通过IGF-1受体(IGF-1R)介导的,它是一类多肽生长因子,IGF-1与受体结合的有效性和IGF-1的促生长、分化作用受IGFBPs的调节。Veness-Meehan等研究发现肺内IGF-1的含量随高氧暴露时间增加而上升,并参与损伤后细胞的生长及肺结构重建。我们前期的研究成果显示内质网应激(ERS)不仅能引起细胞的凋亡,还能影响细胞表型的改变。内质网应激可以激活PI3K/Akt, Akt可导致GSK-3β活性下调,而GSK-3β参与肺上皮-间质转化(EMT)。本文第一部分研究利用制备高氧肺损伤新生大鼠模型,通过外源性IGF-1的干预,观察新生大鼠高氧肺损伤中肺组织病理形态学改变和炎症因子的表达影响,进一步探讨IGF-1通过何种机制抑制高氧诱导的肺细胞凋亡,是否会对高氧肺损伤起到保护作用。第二部分研究上皮间质转化机制在高氧肺损伤发生过程中的调控作用及IGF-1的干预影响。通过制备新生大鼠高氧肺损伤模型,观察肺组织中EMT分子标志物的变化和肺纤维化的程度,进一步探讨IGF-1干预EMT在高氧性肺损伤过程中的调控作用的机制,为高氧肺损伤的预防和和治疗以及IGF-1的临床应用提供实验依据。第一部分IGF-1对新生大鼠高氧肺损伤中TNF-α、IL-1β、IL-6的影响目的：探讨IGF-1对新生大鼠高氧肺损伤中TNF-α、IL-1β、IL-6的影响。方法：选择足月新生Wistar大鼠持续吸入95%的O2制作高氧性肺损伤模型,随机分为高氧模型+IGF-1组,高氧模型+生理盐水(NS)组,空气+NS对照组,所有组按照给药(给NS)时间分为1、3、7、14四个组。各组均于生后1、3、7、14天分批处死采取肺组织标本,并检测大鼠肺组织肺干湿重比(W/D)；采用HE染色观察肺泡发育和肺组织病理形态学改变；采用TUNEL染色法观察肺细胞凋亡；采用酶联免疫法(ELISA)检测新生大鼠肺组织中TNF-α、IL-1β、IL-6的表达含量。结果：1.肺干湿重比(W／D比值)测定：高氧模+NS组第3、7、14天肺W/D比值较同一时间点空气对照组明显增加,有显著性差异(P0.05),高氧+IGF-1组3、7、14天时肺w/D比值较同一时间点高氧+NS组明显降低,有显著性差异(P0.05),较空气对照组3天、7天、14天肺W／D比值明显增加,有显著性差异(P0.05)。2.HE染色结果：光镜下观察空气对照组大鼠肺组织结构正常,肺间质无水肿,可见较少炎症细胞浸润。高氧暴露3d时模型组大鼠肺内小血管扩张充血、水肿,炎症细胞渗出,以中性粒细胞、淋巴细胞为主；7d时肺泡明显减少,肺泡壁厚薄不均,肺泡分化异常,炎性细胞浸润明显增多；14天时上述变化更明显,并出现肺纤维化。高氧+IGF-1组高氧暴露1d时病理表现与同一天高氧+NS组相似；3d、7d、14d时病理改变可见炎症细胞浸润,肺泡壁水肿,肺泡体积扩大,纤维组织增生,较同一天高氧+NS组明显减轻。3.TUNEL染色结果：空气对照组肺组织中可见少量细胞凋亡阳性细胞;高氧+NS组大鼠高浓度氧暴露1d、3d、7d、14d时,肺组织中可见大量的凋亡阳性细胞,凋亡指数均高于正常对照组,有显著性差异(P0.05)。高氧+IGF-1组与同一天高氧+NS组比较凋亡指数明显降低,有显著性差异(P0.05)。4.肺组织中TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平：高氧+NS组大鼠肺组织中TNF-α、 IL-1β、IL-6表达水平在高浓度氧暴露Id、3d、7d、14d时,较对照组明显增高,有显著性差异(P0.05), TNF-α、IL-1β、IL-6表达随延长高氧暴露时间逐渐增高,7d时达到高峰,到14d时,肺组织中细胞因子的表达水平逐渐降低；高氧+IGF-1组大鼠高氧暴露3d、7d、14d时肺组织中TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平较高氧+NS组明显降低,有显著性差异(P0.05),较空气对照组明显增高(P0.05)。结论：1.高氧暴露可引起新生大鼠肺组织产生急性肺损伤的病理性改变,并随着高氧暴露时间延长显示更明显。2.IGF-1减轻高氧暴露引起的肺水肿,抑制炎症因子的释放,阻止高氧肺损伤细胞凋亡。3.IGF-1对新生大鼠高氧肺损伤有保护作用。第二部分 EMT对新生大鼠高氧肺损伤的调控作用及IGF-1的干预目的：探讨EMT对新生大鼠高氧肺损伤的调控作用及IGF-1的干预影响。方法：选择足月新生Wistar大鼠持续吸入95%的O2制作高氧肺损伤模型,随机分为高氧模型+IGF-1组,高氧模型+生理盐水(NS)组,空气+NS对照组,所有组按照给药(给NS)时间分为1天、3天、7天、14天四个组。各组均于生后1、3、7、14天分批处死采取肺组织标本,并检测大鼠肺组织肺干湿重比；利用HE染色和Masson染色方法,观察肺组织病理形态学改变和纤维化程度；利用Western blotting方法检测肺组织中Slug, Snaill、GSK3β、p-GSK3β、Akt、p-Akt、α-SMA蛋白的表达水平。结果：1.肺干湿重比(W/D比值)测定：高氧+IGF-1组高氧3d、7d、14d时肺W/D比值较同一天高氧+NS组降低,有显著性差异(P0.05),高氧+NS组高氧暴露3d、7d、14d肺组织W/D比值较空气对照组明显增加,有显著性差异(P0.05)。2.HE染色结果：空气对照组新生大鼠在生后1d、3d、7d、14d时肺组织中肺泡结构完整,肺间质无水肿,可见较少炎症细胞浸润。高氧+NS组大鼠高氧暴露3d时肺组织病理切片显示肺内小血管扩张充血、血管壁及小支气管壁轻度水肿,肺泡上皮肿胀,肺泡腔及小气道周围可见少量炎症细胞,以大量的红细胞,中性粒细胞、淋巴细胞为主；高氧暴露7d时肺泡明显减少,肺泡壁厚薄不均,肺泡分化异常,炎性细胞浸润明显增多；高氧暴露14d时上述变化更明显,并出现纤维组织增生。高氧+IGF-1组大鼠高氧暴露1d时病理表现与同一天高氧+NS组相似,高氧暴露3d、7d、14d时病理改变为可见炎症细胞浸润,肺泡壁水肿,肺泡体积扩大,纤维组织增生,较同一天高氧+NS组明显减轻。3. Masson染色结果：高氧+NS组大鼠1d时肺泡结构尚完整,肺泡腔内或间质有红细胞渗出,支气管和血管壁可有极少量胶原纤维的沉积；3d时肺泡间隔增宽,肺泡结构部分破坏,渗出增多,支气管和血管壁可有少量胶原纤维的沉积；生后7d14d时开始肺组织内可见肺泡结构破坏较明显, 支气管壁和血管壁以及管周大量纤维增生, 间质中有大量蓝色胶原纤维沉积, 间隔中可见到增生的成纤维细胞。高氧+IGF-1组大鼠在高氧暴露7d、14时肺组织病理改变表现为肺泡结构破坏明显,管壁增厚,增厚的肺间隔中见到蓝色胶原纤维沉积增多和大量增生的成纤维细胞,支气管壁出现纤维化,较同一天高氧模型组病理改变有所减轻。4. Westernblotting测定结果：正常对照组大鼠肺组织中Slug、Snaill、GSK3 β、p-GSK3β、Akt、p-Akt、α-SMA蛋白含量有少量表达;高氧+NS组大鼠高氧暴露3d、7d时肺组织中Slug、Snaill、GSK-3β、p-GSK-3β、Akt、p-Akt、α-SMA蛋白含量较正常对照组明显增高(P0.05),高氧暴露14d,肺组织中Slug、Snaill、 GSK3β、p-GSK3β、Akt、p-Akt、α-SMA蛋白含量增高更明显(P0.05);高氧+IGF-1组大鼠肺组织内上述蛋白含量在高氧暴露1d、3d与同一天高氧+NS组比较无明显差异(P0.05),高氧暴露7d、14d时高氧+IGF-1组大鼠肺组织内上述蛋白含量与同一天高氧+NS组此较表达明显减少(P0.05)。结论：1.高浓度氧可诱发肺水肿、炎症反应,并随着高氧暴露时间延长显示更明显。2.高氧暴露可引起新生大鼠高氧肺组织发生纤维化改变,随着高氧暴露时间延长,纤维化程度更明显。3.高氧暴露下,新生大鼠肺内上皮细胞表型发生改变,促进肺内上皮间质转化发生,肺组织中Slug、Snaill、GSK-3β、p-GSK-3β、Akt、p-Akt、α-SMA蛋白表达含量逐渐增加。4.IGF-1可减轻高氧暴露引起的肺水肿,抑制肺组织中Slug、Snaill、GSK-3β、 P-GSK-3β、Akt、p-Akt、α-SMA蛋白表达,对高氧肺损伤有保护作用。
【关键词】：高氧肺损伤 IGF-1 细胞凋亡 TNF-α IL-1β IL-6 高氧肺损伤 上皮间质转化(EMT) 肺纤维化 IGF-1
【学位授予单位】：延边大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R722.1
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