逆转BNIP3L/NIX降解所致线粒体自噬缺失在缺血性神经损伤中的保护作用研究
发布时间：2021-02-15 10:22
缺血性脑卒中,又称中风,是一种急性脑血管疾病,由血管狭窄或者堵塞造成脑组织血流灌注不足而引起。脑卒中造成不可逆的神经损伤,严重影响患者的运动功能、感觉功能和认知能力。目前脑卒中的临床治疗药物十分有限,以溶栓药组织型纤溶酶原激活剂（tissue plasminogen activator,tPA）为主,但是tPA的使用受到很多限制,真正受益的患者很少。脑卒中复杂的病理机制是造成抗脑卒中药物研发困难的主要原因之一。因此急需对脑卒中的病理机制进行深入研究,并在此基础上寻找潜在的药物干预新靶标。自噬是一种通过溶酶体途径的细胞内降解过程,自噬清除损伤蛋白和细胞器,对维持细胞内稳态十分关键。本课题组前期研究表明,脑卒中后的血流复灌过程引发自噬激活,自噬通过清除损伤线粒体,即线粒体自噬,减少神经元凋亡并减轻缺血性神经损伤。线粒体外膜蛋白BNIP3L/NIX通过与自噬泡蛋白LC3相互作用介导了缺血/复灌过程中的线粒体自噬。然而,课题组前期研究初步发现,在单一的缺血过程中神经元虽有自噬激活,线粒体却未被有效清除,即存在线粒体自噬缺失。如能明确缺血过程中神经元的线粒体自噬缺失的机制并对其进行逆转,则可能为...
【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：105 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
线粒体自噬在小鼠永久性脑缺血中无法激活
为进一步明确上述现象,体外培养的原代皮层神经元,经氧糖剥夺再灌(O-R)或氧糖剥夺(OGD)处理后,同样发现O-R和OGD均引起SQSTM1/GAPDH减少,LC3-II/GAPDH增加,提示在体外培养的神经元中缺血后自噬仍然激活(图1-2.A和B)。O-R引起线粒体膜蛋白COX4I1和TOMM20水平下降,而OGD则不能。为进一步验证自噬的发生,使用溶酶体抑制剂氯喹(chloroquine,CQ)。氯喹可以使溶酶体内的pH升高,抑制自噬泡和溶酶体的结合,从而抑制自噬。蛋白免疫印迹的结果显示仅在O-R中,给予氯喹可以使LC3-II/GAPDH进一步累积,逆转SQSTM1/GAPDH,COX4I1和TOMM20的减少,提示O-R中线粒体自噬激活,OGD则不能激活线粒体自噬。为进一步明确永久性脑缺血后线粒体自噬缺失,在Atg7fl/fl小鼠原代皮层神经元培养5天后加入nestin-CRE病毒,得到自噬相关基因7(ATG7)敲除的神经元,进行O-R和OGD处理。ATG7是形成自噬的重要蛋白,该基因的缺失会抑制自噬泡的产生。免疫印迹的结果显示,ATG7基因敲除抑制了自噬,表现为SQSTM1的累积,LC3-II的减少。在O-R神经元中的线粒体膜蛋白COX4I1和TOMM20的含量随自噬的抑制而累积,提示缺血再灌的神经元中自噬抑制从而导致了线粒体自噬抑制。而OGD神经元的线粒体无论在野生型或者ATG7基因敲除的神经元中均无显著性差异,提示自噬抑制并不影响永久性缺血神经元中线粒体自噬(图1-3 A和B)。以上结果表明抑制自噬不能影响OGD导致的线粒体自噬缺失,提示永久性脑缺血后线粒体自噬的缺失不是自噬缺失引起的。
为进一步明确永久性脑缺血后线粒体自噬缺失,在Atg7fl/fl小鼠原代皮层神经元培养5天后加入nestin-CRE病毒,得到自噬相关基因7(ATG7)敲除的神经元,进行O-R和OGD处理。ATG7是形成自噬的重要蛋白,该基因的缺失会抑制自噬泡的产生。免疫印迹的结果显示,ATG7基因敲除抑制了自噬,表现为SQSTM1的累积,LC3-II的减少。在O-R神经元中的线粒体膜蛋白COX4I1和TOMM20的含量随自噬的抑制而累积,提示缺血再灌的神经元中自噬抑制从而导致了线粒体自噬抑制。而OGD神经元的线粒体无论在野生型或者ATG7基因敲除的神经元中均无显著性差异,提示自噬抑制并不影响永久性缺血神经元中线粒体自噬(图1-3 A和B)。以上结果表明抑制自噬不能影响OGD导致的线粒体自噬缺失,提示永久性脑缺血后线粒体自噬的缺失不是自噬缺失引起的。为了更直接地观察到线粒体自噬的发生,我们分别用标记自噬泡的mCherry-LC3B和线粒体的Mito-GFP转染神经元,使用共聚焦显微镜观察二者的共定位情况。共聚焦的结果显示O-R和OGD处理均增加了自噬泡的数量,提示自噬的激活。O-R可以促使线粒体与自噬泡的融合,线粒体数量的减少;而只进行OGD时,出现大量的线粒体累积,线粒体与自噬泡并不融合,提示线粒体自噬功能障碍(图1-4.A和B)。MitoQC同样是检测线粒体自噬的荧光探针。线粒体自噬未发生时,细胞内的线粒体同时被mCherry和GFP标记,呈现黄色;当线粒体自噬激活时,线粒体被递送到酸性溶酶体内,GFP被淬灭,因此线粒体只带有mCherry荧光,呈现红色。结果显示在O-R减少了线粒体的含量(mCherry+),而OGD则相反,提示尽管自噬激活,但缺血不复灌的神经元中线粒体自噬缺失。
【参考文献】：
期刊论文
[1]Ubiquitin-proteasome system and oxidative stress in liver transplantation[J]. Norma Alva,Arnau Panisello-Roselló,Marta Flores,Joan Roselló-Catafau,Teresa Carbonell. World Journal of Gastroenterology. 2018(31)
[2]Puerarin protects rat brain against ischemia/reperfusion injury by suppressing autophagy via the AMPK-mT OR-ULK1 signaling pathway[J]. Jin-Feng Wang,Zhi-Gang Mei,Yang Fu,Song-Bai Yang,Shi-Zhong Zhang,Wei-Feng Huang,Li Xiong,Hua-Jun Zhou,Wei Tao,Zhi-Tao Feng. Neural Regeneration Research. 2018(06)
[3]Regulation of mitophagy in ischemic brain injury[J]. Yang Yuan,Xiangnan Zhang,Yanrong Zheng,Zhong Chen. Neuroscience Bulletin. 2015(04)
本文编号：3034664
【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：105 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
线粒体自噬在小鼠永久性脑缺血中无法激活
为进一步明确上述现象,体外培养的原代皮层神经元,经氧糖剥夺再灌(O-R)或氧糖剥夺(OGD)处理后,同样发现O-R和OGD均引起SQSTM1/GAPDH减少,LC3-II/GAPDH增加,提示在体外培养的神经元中缺血后自噬仍然激活(图1-2.A和B)。O-R引起线粒体膜蛋白COX4I1和TOMM20水平下降,而OGD则不能。为进一步验证自噬的发生,使用溶酶体抑制剂氯喹(chloroquine,CQ)。氯喹可以使溶酶体内的pH升高,抑制自噬泡和溶酶体的结合,从而抑制自噬。蛋白免疫印迹的结果显示仅在O-R中,给予氯喹可以使LC3-II/GAPDH进一步累积,逆转SQSTM1/GAPDH,COX4I1和TOMM20的减少,提示O-R中线粒体自噬激活,OGD则不能激活线粒体自噬。为进一步明确永久性脑缺血后线粒体自噬缺失,在Atg7fl/fl小鼠原代皮层神经元培养5天后加入nestin-CRE病毒,得到自噬相关基因7(ATG7)敲除的神经元,进行O-R和OGD处理。ATG7是形成自噬的重要蛋白,该基因的缺失会抑制自噬泡的产生。免疫印迹的结果显示,ATG7基因敲除抑制了自噬,表现为SQSTM1的累积,LC3-II的减少。在O-R神经元中的线粒体膜蛋白COX4I1和TOMM20的含量随自噬的抑制而累积,提示缺血再灌的神经元中自噬抑制从而导致了线粒体自噬抑制。而OGD神经元的线粒体无论在野生型或者ATG7基因敲除的神经元中均无显著性差异,提示自噬抑制并不影响永久性缺血神经元中线粒体自噬(图1-3 A和B)。以上结果表明抑制自噬不能影响OGD导致的线粒体自噬缺失,提示永久性脑缺血后线粒体自噬的缺失不是自噬缺失引起的。
为进一步明确永久性脑缺血后线粒体自噬缺失,在Atg7fl/fl小鼠原代皮层神经元培养5天后加入nestin-CRE病毒,得到自噬相关基因7(ATG7)敲除的神经元,进行O-R和OGD处理。ATG7是形成自噬的重要蛋白,该基因的缺失会抑制自噬泡的产生。免疫印迹的结果显示,ATG7基因敲除抑制了自噬,表现为SQSTM1的累积,LC3-II的减少。在O-R神经元中的线粒体膜蛋白COX4I1和TOMM20的含量随自噬的抑制而累积,提示缺血再灌的神经元中自噬抑制从而导致了线粒体自噬抑制。而OGD神经元的线粒体无论在野生型或者ATG7基因敲除的神经元中均无显著性差异,提示自噬抑制并不影响永久性缺血神经元中线粒体自噬(图1-3 A和B)。以上结果表明抑制自噬不能影响OGD导致的线粒体自噬缺失,提示永久性脑缺血后线粒体自噬的缺失不是自噬缺失引起的。为了更直接地观察到线粒体自噬的发生,我们分别用标记自噬泡的mCherry-LC3B和线粒体的Mito-GFP转染神经元,使用共聚焦显微镜观察二者的共定位情况。共聚焦的结果显示O-R和OGD处理均增加了自噬泡的数量,提示自噬的激活。O-R可以促使线粒体与自噬泡的融合,线粒体数量的减少;而只进行OGD时,出现大量的线粒体累积,线粒体与自噬泡并不融合,提示线粒体自噬功能障碍(图1-4.A和B)。MitoQC同样是检测线粒体自噬的荧光探针。线粒体自噬未发生时,细胞内的线粒体同时被mCherry和GFP标记,呈现黄色;当线粒体自噬激活时,线粒体被递送到酸性溶酶体内,GFP被淬灭,因此线粒体只带有mCherry荧光,呈现红色。结果显示在O-R减少了线粒体的含量(mCherry+),而OGD则相反,提示尽管自噬激活,但缺血不复灌的神经元中线粒体自噬缺失。
【参考文献】：
期刊论文
[1]Ubiquitin-proteasome system and oxidative stress in liver transplantation[J]. Norma Alva,Arnau Panisello-Roselló,Marta Flores,Joan Roselló-Catafau,Teresa Carbonell. World Journal of Gastroenterology. 2018(31)
[2]Puerarin protects rat brain against ischemia/reperfusion injury by suppressing autophagy via the AMPK-mT OR-ULK1 signaling pathway[J]. Jin-Feng Wang,Zhi-Gang Mei,Yang Fu,Song-Bai Yang,Shi-Zhong Zhang,Wei-Feng Huang,Li Xiong,Hua-Jun Zhou,Wei Tao,Zhi-Tao Feng. Neural Regeneration Research. 2018(06)
[3]Regulation of mitophagy in ischemic brain injury[J]. Yang Yuan,Xiangnan Zhang,Yanrong Zheng,Zhong Chen. Neuroscience Bulletin. 2015(04)
本文编号：3034664
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