粗糠柴霉素提高膀胱癌细胞对放疗敏感性作用机理研究

发布时间：2017-04-13 13:12

  本文关键词：粗糠柴霉素提高膀胱癌细胞对放疗敏感性作用机理研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:研究粗糠柴霉素(Rottlerin)对膀胱肿瘤细胞生长抑制及其对膀胱肿瘤放射增敏的影响,并阐明其作用机制,为粗糠柴霉素联合放疗治疗膀胱肿瘤的临床应用提供理论依据。方法:四甲基偶氮唑盐实验(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide,MTT)测定粗糠柴霉素对EJ细胞生长的抑制效应;实时定量PCR(Real-time quantitative PCR,qRT-PCR)筛选有效自噬相关基因Atg12的siRN A;透射电镜检测粗糠柴霉素及不同剂量放射线照射后处理后自噬体的形成情况;流式细胞技术检测粗糠柴霉素对细胞周期和细胞凋亡率影响;Western Blotting检测粗糠柴霉素处理后自噬相关蛋白LC3Ⅱ的表达,以及对凋亡相关蛋白Caspase-3,PARP表达的影响;同时用粗糠柴霉素和Atg12的siRNA和放射线联合作用后通过克隆形成实验计算存活分数,来判断到底是促进自噬还是抑制自噬能增加放疗敏感性。Western Blotting检测粗糠柴霉素和Atg12的siRNA联合放疗后自噬相关蛋白LC3Ⅱ的表达;流式细胞技术检测粗糠柴霉素联合放射线治疗后对细胞周期和细胞凋亡率影响;采用Western Blotting检测凋亡相关蛋白Caspase-3,PARP表达。结果:(1)经不同浓度(0,0.5,1,2,4,8,16μM)粗糠柴霉素分别处理24小时,48小时和72小时,EJ细胞增殖活力降低,0.5,1μM的粗糠柴霉素几乎对EJ细胞没有作用,浓度增加到2μM以上时(4,6,8,16μM)细胞存活率明显低于对照组,粗糠柴霉素对EJ细胞的抑制作用具有时间和剂量依赖关系。(2)EJ细胞经2μM粗糠柴霉素处理48小时后,克隆形成实验发现粗糠柴霉素可以减少EJ细胞的克隆形成数。和对照组相比它可降低EJ细胞形成克隆的能力。(3)EJ细胞经2μM粗糠柴霉素处理48小时后,Western Blotting检测粗糠柴霉素处理后自噬相关蛋白LC3Ⅱ的表达增高,透射电镜检测自噬体形成增多。(4)EJ细胞经过放射线不同剂量照射后,通过计算生存分数,粗糠柴霉素可以提高EJ细胞的放射敏感性,2Gy即可轻度增加放射敏感性,但从4Gy开始放射敏感性增加较明显。siRNA与x-射线联合作用显示效果不是很明显,但是也有轻度抑制辐射的细胞杀伤效果。(5)粗糠柴霉素处理EJ细胞受到2Gy、4Gy射线照射24小时后,和单纯受到2Gy、4Gy射线照射的EJ细胞相比均发生G1期阻滞。而单纯放射线照射和未照射的细胞相比,细胞周期的阻滞发生在G2期。(6)细胞受到2Gy、4Gy照射的凋亡率分别为5.55%、16.88%,说明EJ细胞对于放射治疗具有一定的抗性,但是粗糠柴霉素联合x射线处理细胞后使细胞的凋亡率明显增加,2Gy、4Gy照射的凋亡率分别达到65.5%、72.43%。(7)对照组和2μM粗糠柴霉素处理EJ细胞24小时后,细胞受到2Gy射线照射,照射完成后接着培养24小时,Caspase-3、PARP和活化的Caspase-3、PARP在粗糠柴霉素处理前后并无明显的变化。同样在放射线照射前后也无明显变化。结论:以上研究结果说明,粗糠柴霉素具有抑制膀胱肿瘤细胞生长的作用,和x-ray联合应用可提高膀胱肿瘤的放疗效果。
【关键词】：粗糠柴霉素 膀胱癌细胞 自噬 凋亡
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.14
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-7
• 英文缩略词表7-11
• 前言11-32
• 1.1 膀胱癌概述11-14
• 1.1.1 膀胱癌的现状11
• 1.1.2 膀胱癌的发病危险因素11-12
• 1.1.3 膀胱癌的组织、病理学分级12-13
• 1.1.4 膀胱癌的治疗13-14
• 1.2 自噬14-24
• 1.2.1 自噬的概念15
• 1.2.2 自噬形成的分子机制15-17
• 1.2.3 自噬形成的检测方法17-18
• 1.2.4 自噬的调节机制18-22
• 1.2.5 自噬在肿瘤中的作用22-23
• 1.2.6 自噬与肿瘤治疗23-24
• 1.2.7 自噬与凋亡的关系24
• 1.3 细胞凋亡24-27
• 1.3.1 细胞凋亡的概述25
• 1.3.2 细胞凋亡的调控因素25-27
• 1.3.3 细胞凋亡与肿瘤的关系27
• 1.4 粗糠柴霉素27-28
• 1.4.1 粗糠柴霉素的概述27-28
• 1.4.2 粗糠柴霉素在抗肿瘤中的作用28
• 1.5 研究的目的和意义28-30
• 第一部分 技术路线图30-31
• 第二部分 技术路线图31-32
• 第一章 粗糠柴霉素诱导EJ细胞凋亡32-50
• 1.1 材料32-33
• 1.1.1 药品和试剂32
• 1.1.2 仪器32-33
• 1.2 方法33-42
• 1.2.1 主要试剂配制33-34
• 1.2.2 细胞复苏、培养、传代、冻存34
• 1.2.3 MTT比色实验34-35
• 1.2.4 克隆形成实验35
• 1.2.5 透射电镜检测自噬发生35-36
• 1.2.6 Western Blotting36-40
• 1.2.7 AnnexinⅤ/PI双标记检测凋亡细胞40-41
• 1.2.8 流式细胞术检测细胞周期41-42
• 1.2.9 统计学分析42
• 1.3 结果42-47
• 1.3.1 粗糠柴霉素抑制膀胱癌细胞的生长42-43
• 1.3.2 克隆形成实验43
• 1.3.3 粗糠柴霉素处理后EJ细胞内LC3-Ⅱ的形成43-45
• 1.3.4 细胞周期变化45-46
• 1.3.5 粗糠柴霉素增加EJ细胞的凋亡诱导作用46-47
• 1.3.6 Caspase-3 和PARP47
• 1.4 讨论47-49
• 1.5 结论49-50
• 第二章 粗糠柴霉素增加EJ细胞放射治疗敏感性50-72
• 2.1 材料50-51
• 2.1.1 药品和试剂50
• 2.1.2 仪器50-51
• 2.2 方法51-57
• 2.2.1 主要试剂配制51-52
• 2.2.2 细胞复苏、培养、传代、冻存52
• 2.2.3 siRNA的转染及其转染效率测定52-53
• 2.2.4 有效siRN A的序列的筛选53-55
• 2.2.5 克隆形成实验55-56
• 2.2.6 透射电镜检测自噬发生56
• 2.2.7 Western Blotting56
• 2.2.8 流式细胞术检测凋亡56
• 2.2.9 流式细胞术检测细胞周期56-57
• 2.2.10 统计学分析57
• 2.3 结果57-69
• 2.3.1 siRN A导入靶细胞的效率57
• 2.3.2 siRN A抑制EJ细胞Atg12基因mRNA的表达57-60
• 2.3.3 受辐射后细胞的自噬通路被激活60-61
• 2.3.4 使用自噬诱导剂和抑制剂可以影响EJ细胞的放射敏感性61-63
• 2.3.5 放射线处理前后EJ细胞内LC3-Ⅱ的变化63-64
• 2.3.6 细胞周期变化64-67
• 2.3.7 粗糠柴霉素增加EJ细胞的凋亡诱导作用67-69
• 2.3.8 Caspase-3 和PARP69
• 2.4 讨论69-71
• 2.5 结论71-72
• 参考文献72-80
• 在学期间的研究成果80-81
• 致谢81

  本文关键词：粗糠柴霉素提高膀胱癌细胞对放疗敏感性作用机理研究，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：303673