MALAT1在食管癌发生中的作用与机制研究及其与食管癌易感性的关联分析

发布时间：2017-04-13 17:23

  本文关键词：MALAT1在食管癌发生中的作用与机制研究及其与食管癌易感性的关联分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：食管癌是一种高致死性的恶性肿瘤,我国西南地区是食管癌的高发地区之一,其中以鳞状细胞癌分布最广,大约占患者总数的90%以上,预后极差。每年因食管癌死亡人数众多,降低食管癌死亡率的一大原则在于早期诊断及治疗,其重点在于发现食管癌的易感人群及进行早期干预。食管癌的发病风险受到环境因素和遗传因素的共同作用,目前的研究表明,某些特殊饮食及生活习惯的人群更易于罹患食管癌,例如喜食腌制食品、喜热饮热食、长期饮酒及大量吸烟者。近年来,随着人们对基因组学的认识不断深入,遗传因素在食管癌发病机制中的地位逐渐被认识。人们发现,携带某些特定基因变异的人群,患肿瘤的风险性更高,这些变异往往出现在与物质代谢及肿瘤恶性行为相关的基因位点。与肿瘤易感性相关的遗传变异包括寡核苷酸多态性及基因组拷贝数变异。人们对于前者的认识已较为充分,而对后者的关注则相对较晚。由于拷贝数变异的研究方法所限,人们对于拷贝数变异与肿瘤易感性之间关系的认识还极为局限,对于其与食管癌的易感风险之间的认识更是知之甚少。此外,前期的研究主要集中于具有蛋白编码功能的基因序列的拷贝数变异,近年来的研究已经表明,非编码RNA在肿瘤的发生中扮演着同样重要的角色,出现于非编码RNA位点的寡核苷酸的多态性同样可以改变人群患肿瘤的风险,在本研究中,我们将对一些与肿瘤发生、转移密切相关的m RNA及非编码RNA基因位点的拷贝数变异是否与肿瘤易感风向相关做出探讨。这些位点均取自于食管癌组织中的高频变异区,如3q26,8q24及11q13。长链非编码RNA是近年来肿瘤学研究的一大热点,既往人们认为,基因组中大量不具备蛋白编码功能的RNA序列在生命活动过程中并没有任何意义,是进化过程中的垃圾序列。然而,近年来的研究越来越多的显示,这些不具备编码功能的RNA,在生命活动过程中同样扮演着极为重要的角色。长链非编码RNA是其中极为重要的一类非编码RNA分子。长链非编码RNA在肿瘤发生过程中的作用尤为引人关注,在目前几乎所有的人类恶性肿瘤中,均发现了长链非编码RNA参与其中。目前已知的较为经典的肿瘤相关长链非编码RNA包括H19、HOTAIR、GAS5、MEG3、MALAT1等,既往的研究表明,这些长链非编码RNA与多种肿瘤的发生与进展密切相关,如肺癌、乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌等。lnc RNA MALAT1是一种经典的肿瘤相关非编码RNA,其促癌作用已得到广泛认可,但其在食管癌中的作用尚不明确。此外,MALAT1在不同组织中作用方式有别,其在食管癌中的作用与机制有待深入阐明。因此,本研究拟对MALAT1在食管癌中的功能做出初步的评估,在此基础上,深入探讨MALAT1在食管癌中的具体作用方式,全面、深入地解释其在食管癌发生中的机制,为我们认识食管癌的发病及寻找治疗策略提供新的证据。在认识MALAT1在食管癌发生过程中的作用与机制基础上,本研究还试图寻找调控MALAT1表达的表观遗传因素。前期的研究揭示了组蛋白修饰在MALAT1表达水平调控中发挥重要的作用,在本研究中,我们试图探讨表观遗传的另一类机制——启动子区的Cp G岛甲基化能否对MALAT1的表达起调控作用。我们的研究结果显示:1、所挑取的MALAT1、PRKCI等四个肿瘤相关位点的拷贝数变异与食管癌的易感性均无明显关联;2、MALAT1在食管癌组织中呈明显的拷贝数扩增,且扩增与其在食管癌组织中的过表达相关;MALAT1主要在晚期食管癌组织中呈现过表达趋势,在早期食管癌中过表达不明显。表明MALAT1主要促进食管癌的深层进展而不是其肿瘤发生;3、MALAT1的表达干扰抑制了食管癌的增殖,转移功能,并导致了G2/M期阻滞,以及凋亡比例增加;我们的研究结果还显示,MALAT1的干扰可通过磷酸化激活ATM-CHK2通路,该通路的激活与G2/M阻滞有关;在肿瘤组织中,MALAT1的表达水平与ATM-CHK2通路的磷酸化水平呈负关联,说明MALAT1的过表达可能通过对ATM-CHK2通路去磷酸化修饰,抑制ATM-CHK2通路的激活,使其对DNA损伤的敏感性降低,解除DNA损伤引起的周期阻滞,从而促进食管癌的快速生长;4、Cp G岛甲基化水平对MALAT1的表达水平并无明显影响。本文的主要研究内容如下:1、MALAT1、PRKCI等肿瘤相关基因的拷贝数变异与食管癌易感性的关联分析我们首先对食管癌组织中常见的染色体变异区进行了文献回顾分析,发现3q26,8q24,11q13等区域在食管癌组织中的扩增趋势十分明显,基于生殖系(血液标本)与实体细胞(组织细胞)中遗传变异可能存在关联这一假说,我们将候选CNV确定在这几个区域之内。联合生物信息学及双荧光素酶报告基因实验对候选位点进行了系统性的评价,最终确定了位于肿瘤相关基因PRKCI基因座的Variation_59109,长链非编码RNA MALAT1基因座的Variation_65973等共计四个CNV位点作为研究靶点。我们利用一种新开发的CNV分型技术—Accucopy方法对所挑取的CNV位点在生殖系细胞(血液标本)中进行了拷贝数分型,研究对象包括201个食管鳞癌患者及193个健康对照。统计学结果显示,血液标本中这四个位点的拷贝数变异与食管癌的易感性之间并无明显关联。2、lnc RNA MALAT1在食管癌组织中的拷贝数扩增促进其过表达,且其表达水平与食管癌的临床病理特征相关联利用Accucopy技术,我们对食管癌组织中MALAT1的拷贝数也进行了检测,在54例食管癌组织中,我们发现了其中12例组织中出现MALAT1基因的拷贝数扩增。采用q RT-PCR的方法,我们定量检测了MALAT1在这54对食管癌组织及对应的正常食管组织中的表达水平,以及在食管癌细胞株及正常食管上皮细胞株中的表达水平,并对MALAT1的表达水平与肿瘤大小、有无转移等临床病理特征进行关联分析,初步推测MALAT1在食管癌发生过程中所起的作用。结果显示,MALAT1在食管癌组织中的拷贝数扩增与其在食管癌中的过表达相关联,且MALAT1的过表达与肿瘤大小、淋巴结转移相关。3、细胞水平研究表明MALAT1的过表达促进食管癌的生长、迁移与侵袭,其促生长作用与其对ATM-CHK2通路的调控有关通过si RNA干扰技术沉默MALAT1在食管癌细胞株EC109、EC9706、KYSE150及KYSE450中的表达水平,并通过CCK8法、平板克隆形成实验、裸鼠原位成瘤实验、transwell细胞迁移侵袭实验检测MALAT1表达干扰后对食管癌细胞株的生长、克隆形成、迁移、侵袭等肿瘤细胞学行为的影响。通过流式细胞技术检测MALAT1干扰对食管癌细胞株的细胞周期、细胞凋亡的影响,推测其调控食管癌细胞生长的机制。本部分结果显示,对MALAT1进行表达干扰后,食管癌细胞株的生长、迁移、侵袭行为受到抑制,且食管癌细胞株的G2/M期细胞比例增加,凋亡细胞比例也增加。前期报道表明了MALAT1在细胞周期及基因组稳定性维持中的作用,基因组的稳定性与细胞周期进展相关,因此,我们推测MALAT1可能参与到DNA损伤应答通路的调控。我们利用western-blotting法检测了MALAT1干扰前后,ATM-CHK2通路的表达水平及磷酸化水平的改变,该通路的磷酸化激活与细胞周期组织相关。结果显示,MALAT1表达干扰后,ATM-CHK2通路的磷酸化水平显著增高,提示MALAT1的过表达与ATM-CHK2的去磷酸化失活相关,MALAT1可通过对ATM-CHK2通路的调控促进食管癌生长。4、MALAT1的表达水平不受Cp G岛甲基化的调控既往的研究表明MALAT1的表达水平受到组蛋白甲基化、mi RNA及转录因子的调控,表观遗传学机制在MALAT1的表达调控中的意义尚未得到充分揭示。在本研究中,我们首先采用BSP法对MALAT1启动子区的Cp G岛进行了测序,分析其启动子区的DNA甲基化与MALAT1表达水平之间的关系;此外,我们在细胞水平同样证明了MALAT1的表达水平并不受DNA去甲基化酶5-aza-CDR的控制。
【关键词】：食管鳞癌 拷贝数变异 长链非编码RNA MALAT1 周期阻滞
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.1
【目录】：

• 英文缩写一览表5-7
• 英文摘要7-12
• 中文摘要12-16
• 第一章 前言16-19
• 第二章 MALAT1等肿瘤相关基因的生殖系拷贝数变异与食管癌易感性的关联分析19-39
• 2.1 材料与方法21-31
• 2.2 结果31-36
• 2.3 讨论36-39
• 第三章 MALAT1的表达水平与食管癌组织中的拷贝数及临床病理特征之间的关联39-49
• 3.1 材料与方法39-45
• 3.2 结果45-47
• 3.3 讨论47-49
• 第四章 长链非编码RNA MALAT1在食管癌中的功能与机制研究49-65
• 4.1 长链非编码RNA MALAT1在食管癌中的功能研究49-56
• 4.1.1 材料与方法49-52
• 4.1.2 结果52-55
• 4.1.3 讨论55-56
• 4.2 长链非编码RNA MALAT1的过表达促进食管鳞状细胞癌生长的机制研究56-65
• 4.2.1 材料与方法56-60
• 4.2.2 结果60-63
• 4.2.3 讨论63-65
• 第五章 CpG岛甲基化水平与MALAT1表达水平之间的关联研究65-72
• 5.1 材料与方法65-68
• 5.2 结果68-71
• 5.3 讨论71-72
• 全文总结72-74
• 参考文献74-83
• 文献综述一 基因拷贝数变异与人类疾病83-98
• 参考文献92-98
• 文献综述二 长链非编码RNA与肿瘤98-114
• 参考文献108-114
• 攻读博士学位期间的研究成果114-115
• 致谢115-117
• 附录117

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1 胡力文;MALAT1在食管癌发生中的作用与机制研究及其与食管癌易感性的关联分析[D];第三军医大学;2015年

2 刘平平;长链非编码RNA MALAT1在胰腺导管腺癌中的表达及功能研究[D];北京协和医学院;2014年

  本文关键词：MALAT1在食管癌发生中的作用与机制研究及其与食管癌易感性的关联分析，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：304113