膀胱癌特异性溶瘤腺病毒与顺铂或吉西他滨联合抗膀胱肿瘤的体外实验研究

发布时间：2017-04-13 23:06

  本文关键词：膀胱癌特异性溶瘤腺病毒与顺铂或吉西他滨联合抗膀胱肿瘤的体外实验研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一,目前临床多采用以手术治疗为主,辅以化疗、放疗和膀胱灌注等方法的综合治疗,但其治愈率远未令人满意。随着分子生物学、病毒学研究的进展,肿瘤的病毒基因疗法成为近年来非常热门的一种肿瘤生物治疗的方法。有研究报道将化疗和病毒基因治疗相结合杀伤肿瘤细胞具有很好的疗效,为提高肿瘤的治疗效果开辟了新的途径。本课题组成功构建了膀胱癌特异性溶瘤腺病毒Ad/PSCAE/UPII/E1A,该腺病毒在膀胱特异性启动子UPII的控制下能选择性地在膀胱癌细胞中复制进而发挥溶瘤效应,对正常细胞没有影响。顺铂和吉西他滨是临床治疗膀胱癌的常用化疗药物,其作用机制与溶瘤腺病毒不同。本实验将Ad/PSCAE/UPII/E1A与化疗药物联合,旨在研究两者联用是否能发挥协同抗膀胱肿瘤的作用,并初步探讨两者联用的可能的机制,为膀胱癌的治疗提供一种新的治疗策略,并为将来的临床应用提供基础的理论和实验依据。方法：利用膀胱组织特异性启动子UPII控制溶瘤腺病毒E1A基因的表达,并在UPII启动子上游插入前列腺干细胞抗原增强子(PSCAE)以增强UPII启动子的活性,构建出膀胱癌特异性溶瘤腺病毒Ad/PSCAE/UPII/E1A;以萤火虫荧光素酶(Luc)报告基因置换Ad/PSCAE/UPII/E1A中的E1A基因,构建出重组腺病毒Ad/PSCAE/UPII/Luc.利用表达Luc基因的重组腺病毒Ad/PSCAE/UPII/Luc,体外感染膀胱癌细胞株EJ、5637、BIU87和T24,通过检测细胞内Luc的活性观察重组腺病毒对膀胱癌细胞的感染效率；采用Western blot法分析溶瘤腺病毒Ad/PSCAE/UPII/E1A感染膀胱癌细胞后细胞内E1A基因的表达情况；应用MTT比色法检测Ad/PSCAE/UPII/E1A与化疗药(顺铂和吉西他滨)单用或联用对人膀胱癌细胞增殖的影响,并通过联合指数法对联合作用进行分析；采用MTT比色法检钡与化疗药单用或联用对人正常尿Ad/PSCAE/UPII/E1A路上皮细胞SV-HUC-1的细胞毒作用；利用流式细胞术观察与化疗药单用或联用对膀胱癌细胞周期及凋亡的影响；采用Ad/PSCAE/UPII/E1A法观察qRT-PCR与化疗药单用或联用对凋亡信号转导通路相关因子Ad/PSCAE/UPII/E1A表达的影响；采用nRNA法分析Western blot与化疗药单用或联用Ad/PSCAE/UPII/E1A对凋亡信号转导通路相关因子蛋白表达的影响；采用Western blot法检测GEM与Ad/PSCAE/UPII/E1A合用感染T24细胞后E1A基因在细胞中的表达以及GEM对T24细胞表面CAR表达的影响。结果：(1)重组腺病毒Ad/PSCAE/UPII/E1A和Ad/PSCAE/UPII/Luc在HEK293细胞内扩增后,经氯化铯密度梯度离心法纯化,获得了纯度较好且滴度较高的腺病毒；(2)Ad/PSCAE/UPII/Luc在体外能有效感染CAR高表达的膀胱癌细胞株EJ、5637和BIU87,随着感染复数的增加,细胞内Luc活性相应增强,呈剂量依赖性；Ad/PSCAE/UPII/Luc感染CAR低表达的膀胱癌细胞株T24后,细胞内Luc活性很低,说明感染效率差；(3) Ad/PSCAE/UPII/E1A感染CAR高表达的膀胱癌细胞株EJ、5637和BIU87后,三种细胞株内E1A蛋白均呈高表达,说明感染效率高。而Ad/PSCAE/UPII/E1A感染CAR低表达的膀胱癌细胞株T24后,细胞内E1A蛋白的表达很低,说明感染效率差；(4)Ad/PSCAE/UPII/E1A与顺铂分别单用均能抑制CAR高表达的膀胱癌细胞的生长,两者联用具有显著的协同作用；(5)Ad/PSCAE/UPII/E1A与吉西他滨分别单用均能抑制CAR高表达的膀胱癌细胞的生长,两者联用具有显著的协同作用；(6)Ad/PSCAE/UPII/E1A单用不能抑制CAR低表达的T24细胞的生长,与顺铂联用后无协同作用,但在与吉西他滨联用后产生了显著的协同作用；(7)Ad/PSCAE/UPII/E1A能将5637细胞周期阻滞于G1期,顺铂也能将5637细胞周期阻滞于G1期,两者联用对G1期的阻滞程度进一步加剧；(8)Ad/PSCAE/UPII/E1A能将EJ细胞周期阻滞于G1期,吉西他滨能将EJ细胞周期阻滞于S期,两者联用对S期的阻滞程度显著增加；(9)Ad/PSCAE/UPII/E1A与顺铂分别单用均能诱导5637细胞发生凋亡,两者联用后凋亡更加显著；(10)Ad/PSCAE/UPII/E1A与吉西他滨分别单用均能诱导EJ细胞发生凋亡,两者联用后凋亡更加显著；(11)Ad/PSCAE/UPII/E1A与顺铂联用可在转录水平增加Fas及Bax的表达、降低Bcl-2的表达；在蛋白水平上调Fas、Bax、Bak、活化形式的Bid、caspase 8、9、3及PARP的表达,下调Bcl-2和Bcl-XL的表达。说明两者联用可能通过增强外源性及内源性凋亡通路诱导5637细胞凋亡；(12)Ad/PSCAE/UPII/E1A与吉西他滨联用可在转录水平增加Bax的表达、降低Bcl-2的表达；在蛋白水平上调Bax、Bak、活化形式的caspase 9、3及PARP的表达,下调Bcl-2和Bcl-XL的表达。说明两者联用可能通过增强内源性凋亡通路诱导EJ细胞凋亡；(13)吉西他滨能提高Ad/PSCAE/UPII/Luc和Ad/PSCAE/UPII/E1A对T24细胞的感染效率；(14)吉西他滨能诱导T24细胞表面CAR的表达,继而增强重组腺病毒对细胞的感染效率；(15) Ad/PSCAE/UPII/E1A联合小剂量顺铂或吉西他滨对正常尿路上皮细胞的杀伤效应很小,无明显相加毒性。结论：(1)Ad/PSCAE/UPII/E1A 和 Ad/PSCAE/UPII/Luc能在体外有效感染CAR高表达的膀胱癌细胞株EJ、5637和BIU87,具有较高的感染效率,而对CAR低表达的膀胱癌细胞株T24感染效率差；(2)Ad/PSCAE/UPII/E1A能显著抑制CAR高表达的膀胱癌细胞的增殖,并呈剂量及时间依赖性,但对CAR低表达的T24细胞无抑制作用；(3)Ad/PSCAE/UPII/E1A与顺铂联用能协同杀伤CAR高表达的膀胱癌细胞,但对CAR低表达的膀胱癌细胞不产生协同杀伤作用；(4)Ad/PSCAE/UPII/E1A与吉西他滨联用能协同杀伤CAR高表达及低表达的膀胱癌细胞；(5) Ad/PSCAE/UPII/E1A能将膀胱癌细胞周期阻滞于G1期,与顺铂联用后G1期阻滞程度加重,而与吉西他滨联用后将细胞周期阻滞于S期；(6)Ad/PSCAE/UPII/E1A能诱导膀胱癌细胞凋亡,与顺铂或吉西他滨联用后促凋亡作用进一步增强；(7) Ad/PSCAE/UPII/E1A与顺铂联用后可能通过增强外源性及内源性凋亡通路诱导膀胱癌细胞凋亡；(8) Ad/PSCAE/UPII/E1A与吉西他滨联用后可能通过增强内源性凋亡通路诱导膀胱癌细胞凋亡；(9)吉西他滨可能通过诱导T24细胞表面CAR的表达,增强Ad/PSCAE/UPII/E1A对CAR低表达的T24细胞的感染效率,继而发挥协同杀伤T24细胞的作用；(10)Ad/PSCAE/UPII/E1A具有膀胱癌特异性复制能力,与小剂量顺铂或吉西他滨联用对正常细胞无相加毒性。
【关键词】：膀胱癌 溶瘤腺病毒 顺铂 吉西他滨 协同作用
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.14
【目录】：

• 中文摘要3-6
• Abstract6-13
• 前言13-31
• 1.1 膀胱肿瘤及治疗现状13-14
• 1.2 肿瘤基因治疗14-20
• 1.3 膀胱癌特异性溶瘤腺病毒膀胱内灌注治疗及联合治疗20-21
• 1.4 顺铂吉西他滨在膀胱癌治疗中的应用21-22
• 1.5 前期工作、立题依据和本课题主要研究内容22-25
• 参考文献25-31
• 第一部分 膀胱癌特异性溶瘤腺病毒的扩增、纯化及感染效率的测定31-50
• 1.1 实验材料31-34
• 1.1.1 主要材料和试剂31-32
• 1.1.2 主要溶液的配制32-33
• 1.1.3 主要仪器及设备33-34
• 1.2 实验方法34-44
• 1.2.1 HEK293人胚肾细胞的复苏、培养、传代及冻存34-36
• 1.2.2 溶瘤腺病毒的扩增与纯化36-37
• 1.2.3 溶瘤腺病毒滴度的测定37-38
• 1.2.4 膀胱癌细胞的复苏、培养、传代及冻存38-39
• 1.2.5 重组腺病毒对膀胱癌细胞感染效率的测定39-44
• 1.2.6 统计学方法44
• 1.3 结果44-46
• 1.3.1 扩增纯化后重组腺病毒滴度测定结果44
• 1.3.2 重组腺病毒纯度测定结果44-45
• 1.3.3 Ad/PSCAE/UPII/Luc对膀胱癌细胞感染效率的测定45
• 1.3.4 溶瘤腺病毒感染膀胱癌细胞后E1A基因在细胞中的表达45-46
• 1.4 讨论46-48
• 1.5 结论48-49
• 参考文献49-50
• 第二部分 Ad/PSCAE/UPII/E1A与顺铂或吉西他滨联用对膀胱癌细胞生长的抑制作用50-78
• 2.1 实验材料50-52
• 2.1.1 主要材料和试剂50
• 2.1.2 主要溶液的配制50-51
• 2.1.3 主要仪器及设备51-52
• 2.2 实验方法52-56
• 2.2.1 膀胱癌细胞的复苏、培养、传代及冻存52
• 2.2.2 MTT比色法检测细胞活力52-54
• 2.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡54-55
• 2.2.4 流式细胞术检测细胞周期分布55-56
• 2.2.5 统计学方法56
• 2.3 结果56-73
• 2.3.1 Ad/PSCAE/UPII/E1A与顺铂单用对人膀胱癌细胞生长的抑制作用56-58
• 2.3.2 Ad/PSCAE/UPII/E1A与顺铂联用对人膀胱癌细胞生长的抑制作用58-60
• 2.3.3 Ad/PSCAE/UPII/E1A与吉西他滨单用对人膀胱癌细胞生长的抑制作用60-62
• 2.3.4 Ad/PSCAE/UPII/E1A与吉西他滨联用对人膀胱癌细胞生长的抑制作用62-64
• 2.3.5 Ad/PSCAE/UPII/E1A、顺铂与吉西他滨分别单用对正常人尿路上皮细胞SV-HUC-1的影响64-65
• 2.3.6 Ad/PSCAE/UPII/E1A与顺铂或吉西他滨联用对正常人尿路上皮细胞SV-HUC-1的影响65-67
• 2.3.7 Ad/PSCAE/UPII/E1A与顺铂联用对人膀胱癌细胞凋亡的影响67-68
• 2.3.8 Ad/PSCAE/UPII/E1A与吉西他滨联用对人膀胱癌细胞凋亡的影响68-69
• 2.3.9 Ad/PSCAE/UPII/E1A与顺铂联用对人膀胱癌细胞周期分布的影响69-71
• 2.3.10 Ad/PSCAE/UPII/E1A与吉西他滨联用对人膀胱癌细胞周期分布的影响71-73
• 2.4 讨论73-76
• 2.5 结论76-77
• 参考文献77-78
• 第三部分 Ad/PSCAE/UPII/E1A与顺铂或吉西他滨联用发挥协同抗膀胱肿瘤作用的机制78-109
• 3.1 实验材料78-81
• 3.1.1 主要材料和试剂78-79
• 3.1.2 主要仪器及设备79-80
• 3.1.3 主要溶液的配制80-81
• 3.2 实验方法81-90
• 3.2.1 膀胱癌细胞的复苏、培养、传代及冻存81
• 3.2.2 qRT-PCR法检测凋亡相关基因mRNA水平的变化81-84
• 3.2.3 Western blot法检测凋亡相关基因蛋白水平的变化84-88
• 3.2.4 吉西他滨对重组腺病毒感染CAR低表达的膀胱癌细胞的效率的影响88-89
• 3.2.5 Western blot法检测吉西他滨对T24细胞CAR表达的影响89-90
• 3.2.6 统计学方法90
• 3.3 结果90-98
• 3.3.1 Ad/PSCAE/UPII/E1A与顺铂联用对凋亡相关基因表达的影响90-92
• 3.3.2 Ad/PSCAE/UPII/E1A与吉西他滨联用对凋亡相关基因表达的影响92-96
• 3.3.3 吉西他滨对重组腺病毒感染CAR低表达的膀胱癌细胞的效率的影响96-97
• 3.3.4 吉西他滨对T24细胞CAR表达的影响97-98
• 3.4 讨论98-104
• 3.5 结论104-105
• 参考文献105-109
• 中英文缩写索引109-112
• 在学期间的研究成果112-113
• 致谢113

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

1 王晓雷,千新来,赵清正,徐震纲,唐平章;E1A基因对头颈部淋巴结转移鳞癌细胞体外生长的抑制和化放疗增敏的作用[J];癌症;2003年11期

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3 张薇,项永兵,刘振伟,方茹蓉,阮志贤,孙璐,高立峰,金凡,高玉堂;1973-1999年上海市区老年人恶性肿瘤发病趋势分析[J];中华老年医学杂志;2005年09期

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本文编号：304665