树突状细胞Notch信号在1，25-二羟维生素D3调节Th17分化中的作用研究

发布时间：2017-04-16 03:13

  本文关键词：树突状细胞Notch信号在1，25-二羟维生素D3调节Th17分化中的作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景与目的:哮喘是一种具有明显异质性的疾病。根据哮喘气道内浸润的炎症细胞不同,可以把哮喘分成嗜酸细胞性、中性粒细胞性、混合细胞性和寡细胞性哮喘[1]。不同的炎症细胞表型,提示具有不同的免疫学炎症机制。过去用“Th1/Th2失衡学说”来阐述其发病机制,但该学说不能完全解释嗜酸性细胞炎症的发生机制,更不能解释非嗜酸性细胞性炎症的机制。随着更多的辅助性T(Th)细胞的发现,对哮喘发病的免疫学机制认识也在不断的深入。近年发现,调节性T细胞(Regulatory T cells,Treg)和Th17细胞都在哮喘发病中起有重要作用。Treg具有抑制Th分化的作用。Th17则在中性粒细胞炎症中起有重要作用。但Th细胞分化调节的机制仍没有完全阐明。Treg是具有负反馈调节作用的重要T细胞亚群。Treg可以通过抑制其他辅助细胞、辅助细胞效应因子、APC等来完成负反馈作用。大量研究研究显示,哮喘患者存在明显的Tregs分化不足和功能低下。也有文献报道哮喘患者体内存在Th17/Treg失衡。所以我们认为Th17/Treg失衡是中性粒细胞性哮喘发展的重要环节。Th17细胞可以促进中性粒细胞炎症,在哮喘的发展过程中发挥着重要作用。哮喘患者外周血T细胞中发现Th17细胞增多,而其主要细胞因子IL-17A可以促进气道高反应,加重中性粒细胞在气道中的浸润,促进气道的重塑,参与后期气道和全身炎症反应,促进其他炎症因子的生产从而加重哮喘。也有研究发现在重症哮喘患者诱导痰及气管粘膜层IL-17表达显著上升;气道对乙酰甲胆碱的高反应性也与诱导痰IL-17A水平呈正相关。Rhonda等研究发现低剂量脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)可以加重气道内中性粒细胞的浸润,促进气道的高反应性,这与诱导气道内强烈的Th17细胞免疫反应相关。我们前期研究也成功使用低剂量的LPS诱导出以Th17为主的中性粒细胞性哮喘模型。树突状细胞(dendritic cells,DCs)是体内最强的抗原提呈细胞,DCs将抗原信息递呈给T细胞时,可以产生免疫反应或免疫耐受两种不同的结果。在哮喘的发展中,DCs既可以促进以Th2、Th17细胞为主的气道变应性炎症,也可以是调控以Treg为主的免疫耐受。dcs对t细胞的活化是通过三个信号介导:信号1通过t细胞受体(tcr)与mhc-抗原肽复合物相互作用来传递,信号2通过共刺激信号t细胞cd28与dcs上cd80/cd86的相互作用传递,这两个信号共同启动了t细胞的克隆扩增并分化为效应t细胞,另一个信号-nocth信号通路决定了t细胞发育命运。研究显示,dcs过表达delta-like4可以增加il-17的分泌,而中和delta-like4可以抑制体内th17细胞活化[2,3]。lps刺激可以上调delta-like配体,并参与th17细胞的活化[4]。1,25-二羟维生素d3(1α,25-dihydroxyvitamind3,1,25(oh)2d3)是维生素d体内的活性形式,具有重要的免疫调节作用,在哮喘中的作用也较多的研究。我们实验室过去的研究也证实1,25-二羟维生素d3具有调节th细胞分化,诱导tregs活化的作用。也有研究发现,1,25-二羟维生素d3可以通过dc途径间接地抑制th17细胞分化[7]。但是,1,25-二羟维生素d3详细的作用机制并不清楚,1,25-二羟维生素d3是否能通过dcs的notch信号来调节th17细胞的分化目前还没有报道。因此,本实验假设1,25-二羟维生素d3可以通过调节dcs表达的notch配体delta-like4从而抑制th17细胞分化。本实验提取ova致敏小鼠脾脏dcs,分别用lps,lps+dex,lps+vitd3处理小鼠脾脏dcs24小时,然后检测dcs表面mhcⅡ、共刺激分子及各notch配体的表达。然后将处理24小时的dcs与t细胞共培养后,检测各辅助性t细胞的分化,探讨lps及1,25-二羟维生素d3处理的dcs对th17等辅助性t细胞分化的影响。进一步阻断与th17细胞分化相关的差异表达notch配体,探讨1,25-二羟维生素d3对th17细胞分化的机制。研究方法:第一部分:1,25-二羟维生素d3对lps处理的ova致敏的小鼠脾脏dcs表型的影响1.ova致敏小鼠模型的建立在d0、d6给予小鼠腹腔注射0.02%ova-al(oh)3溶液200ul致敏,在第13天后给予1%的ova溶液气道连续雾化3天,得到ova致敏模型小鼠。通过肺泡灌洗液嗜酸性粒细胞比例来判断模型是否成功。2.1,25-二羟维生素d3及lps等对dcs的影响处死模型小鼠后,无菌分离脾脏,将脾脏细胞处理成无红细胞的单细胞悬液,用cd11c免疫磁珠分选出树突状细胞。用1ul/mlpbs处理的dcs作为对照组,1ug/mllps处理的dcs作为lps组,1ug/mllps+1×10-8mol/l地塞米松处理的dcs作为lps+dex组,1ug/mllps+1×10-8mol/l1,25-二羟维生素d3处理的dcs作为lps+vitd3组。各组细胞在5%co2、37℃无菌环境中培养24小时后,进行下一步实验检测。2.1.流式技术检测lps,lps+dex和lps+vitd3处理dcs的凋亡各不同处理因素可能影响dcs的活性,造成不同组别间dcs活性的差异。我们用annexinv/pi检测培养24小时的dcs凋亡程度,以排除后期共培养阶段由于dcs活性差异而导致的t细胞分化差异。2.2.lps,lps+dex和lps+vitd3对dcs表面共刺激分子及mhcⅡ表达影响收集各种处理因素培养24h的dcs,用流式细胞技术检测各组dcs细胞表面mhcⅡ和共刺激分子cd80、cd86、cd40的表达。2.3.westernblot检测lps,lps+dex和lps+vitd3处理dcs表达的notch各配体蛋白水平收集各种处理因素培养24h的dcs,用蛋白裂解液提取各组细胞总蛋白后,用westernblot方法检测各种处理后dcs中notch配体jagged1,jagged2,delta-like1,delta-like3和delta-like4的蛋白表达。2.4.rt-qpcr检测lps,lps+dex和lps+vitd3处理dcs表达的notch各配体mrna水平收集各种处理因素培养24h的dcs,提取各组dcs总rna,逆转录成cdna,通过特异性扩增后,检测各种处理后dcs中notch配体jagged1,jagged2,delta-like1,delta-like3和delta-like4的mrna表达。2.5.elisa检测dcs上清液中细胞因子的表达收集各种处理因素培养24h的dcs的上清液,用elisa检测上清液中il-10、il-23和tgf-β的表达。第二部分:1,25-二羟维生素d3及lps处理ova致敏小鼠脾脏dcs在共培养中对t细胞分化的影响我们在第一部分已经检测到在不同处理因素下dcs处于不同的免疫状态,而这种不同免疫状态的dcs是否会影响t细胞的分化呢?为了进一步检测各因素处理的dcs对t辅助性细胞分化的影响,我们将不同因素处理后的dcs与t细胞共培养24小时,然后检测各型辅助t细胞分化比例及分泌的效应因子。无菌分离ova致敏小鼠脾脏,将脾脏处理为无红细胞的单细胞悬液,用cd4+免疫磁珠分选出t淋巴细胞。收集上述各因素下培养24h的dcs,用1640洗涤dcs,重悬细胞,将dcs和t淋巴细胞按照1:10的比例共培养,将共培养细胞放置在5%co2、37℃环境下培养24h。1.流式细胞技术检测共培养细胞中各辅助性t细胞比例收集培养24h的细胞,调节浓度为1×106个/ml细胞,用pma/lonomycin和bfa/monensin刺激上述细胞6小时后,孵育结合流式抗体cd4+ifn-γ+、cd4+il-4+和cd4+il-17a+,然后用流式仪器检测其阳性表达比例;收集培养24h的细胞,调节浓度为1×106个/ml细胞,直接孵育结合cd4+cd25+foxp3,用流式仪器检测阳性表达率。2.elisa检测共培养上清液中细胞因子收集各种处理因素培养24h的dcs的上清液,用elisa检测上清液中il-4、il-17a和ifn-γ的表达。第三部分:1,25-二羟维生素d3及lps处理ova致敏小鼠脾脏dcs表达的detal-like4配体对th17细胞分化的影响我们在前两部分已经检测了1,25-二羟维生素d3处理对dcs上notch配体表达的影响,同时也检测了1,25-二羟维生素d3对辅助性t细胞分化的影响,那么1,25-二羟维生素d3能否通过调节notch配体表达影响辅助性t细胞的分化呢?本部分实验将在共培养阶段阻断detal-like4配体后,观察辅助性t细胞的分化情况。在共培养阶段,向培养液中加入5ug/ml的detal-like4阻断抗体,然后放置在5%co2、37℃环境下培养24h。1.流式细胞技术检测共培养细胞中各辅助性t细胞比例收集培养24h的细胞,调节浓度为1×106个/ml细胞,用pma/lonomycin和bfa/monensin刺激上述细胞6小时后,孵育结合流式抗体cd4+ifn-γ+、cd4+il-4+和cd4+il-17a+,然后用流式仪器检测其阳性表达比例;收集培养24h的细胞,调节浓度为1×106个/ml细胞,直接孵育结合cd4+cd25+foxp3,用流式仪器检测阳性表达率。2.elisa检测共培养上清液中细胞因子收集各种处理因素培养24h的dcs的上清液,用elisa检测上清液中il-17a表达。研究结果:第一部分:1,25-二羟维生素d3对lps处理的ova致敏的小鼠脾脏树突状细胞表型的影响1.ova致敏小鼠模型的建立模型组小鼠balf中嗜酸性粒细胞比例高于对照组小鼠(p0.05),细胞计数也较对照组显著增多(p0.05),成功复制ova致敏嗜酸粒细胞性哮喘。2.1,25-二羟维生素d3及lps等对dcs的影响2.1.dcs纯度及各因素处理的dcs凋亡率用流式细胞技术检测分离出的模型小鼠脾脏dcs纯度,dcs纯度大于80%,可以进行下一步实验。用流式技术检测经各处理后凋亡状态,各组间的凋亡基本一致,排除由于dcs状态差异引起的t细胞分化差异。2.2.lps,lps+dex和lps+vitd3对dcs表面共刺激分子及mhcⅡ表达影响lps刺激的dcs和模型对照组dcs相比cd80、cd86及mhcⅡ分子表达无显著差异(p0.05),仅cd40表达升高(p0.05),分别为cd80(61.5±11.7%vs58.5±8.4%),cd86(54.4±8%vs65±2.4%),cd40(16.9±3.4%vs31.2.±7.7%),mhcⅡ分子(27.7±8.1%vs27.3±4.3%)。dex或vitd3处理的dcs与lps刺激dcs相比,表达的共刺激分子cd80、cd86、cd40及mhcⅡ分子均无显著降低(p0.05),分别为cd80(64.4±10.5%,65.4±8.0%vs58.5±8.4%),cd86(56.4±2.3%,58.9±1.6%vs65±2.4%),cd40(21.6±2.3%,22.4±8.9%vs31.1±7.7%)mhcⅡ分子(36.4±4.9%,25.8±7.9%vs27.3±4.3%)。当免疫紊乱时,dcs会高表达mhcⅡ分子和共刺激分子,获得成熟的表型及功能,这是的dcs可以特异性的与t淋巴细胞结合,导致t淋巴细胞活化成为效应t细胞。结果显示lps、1,25-二羟维生素d3或者地塞米松处理24小时并不影响dcs共刺激分子及mhcⅡ表达,不影响dcs的成熟状态。2.3.westernblot检测lps,lps+dex和lps+vitd3处理dcs表达的notch各配体蛋白水平和对照组相比,1,25-二羟维生素d3处理后,jagged1蛋白表达升高(p0.05)。jagged2蛋白表达趋势基本与jagged1蛋白表达一致。加入lps刺激后detal-like1表达升高(p0.05),加入1,25-二羟维生素d3处理后dcs表达的detal-like1升高(p0.05),加入地塞米松处理的dcs表达detal-like1与lps组比较降低(p0.05)。dcs表达的detal-like3经lps刺激未见上升(p0.05),同时加入1,25-二羟维生素d3处理的dcs表达detal-like3无显著差异(p0.05)。与对照组相比较,lps刺激的dcs表达的detal-like4增加(p0.05),1,25-二羟维生素d3处理后与仅lps刺激相比较dcs表达的detal-like4有下降(p0.05)。这显示1,25-二羟维生素d3可以调节jagged1,jagged2,delta-like1和delta-like4蛋白水平,而地塞米松调控delta-like1蛋白表达。2.4.rt-qpcr检测lps,lps+dex和lps+vitd3处理dcs表达的notch各配体mrna水平lps刺激dcs后,和模型对照组相比,dcs表达的jagged1mrna上升0.3倍(p0.05),jagged2mrna上升0.2倍(p0.05),detal-like1mrna上升3.5倍(p0.01),detal-like3mrna上升0.4倍(p0.01),detal-like4mrna上升6.5倍(p0.01);在lps刺激的同时加入vitd3或者dex后,发现vitd3组jagged1mrna表达是lps组的1.5倍(p0.05),jagged2mrna是lps组的1.4倍(p0.01),delta-like1mrna是lps组的2.4倍(p0.01),detal-like3mrna是lps组的0.85倍(p0.05),detal-like4mrna是lps组的0.54倍(p0.05);而dex组对jagged1、jagged2、delta-like1、delta-like3无明显影响,而仅detal-like4mrna是lps组0.8倍(p0.05)。notch信号通路是决定t细胞分化重要信号,结果表明1,25-二羟维生素d3可以调节各notch配体mrna表达,地塞米松能下调delta-like4mrna表达,可能提示1,25-二羟维生素d3可以通过调节notch信号从而调控t细胞分化,这需要进一步实验证明。2.5.elisa检测dcs上清液中细胞因子的表达对照组小鼠脾脏dcs低分泌il-10(10.35±1.85)pg/ml,il-23(4.28±0.95)pg/ml,高分泌tgf-β(592.59±60.16)pg/ml,lps处理的dcs高分泌il-10(110.72±9.16)pg/ml、tgf-β(840.44±109.3)pg/ml,对il-23(3.56±1.05)pg/ml分泌未有明显影响。在lps处理dcs的同时加入地塞米松的dcs低分泌il-10(72.69±5.05)pg/ml和tgf-β(615.54±9.56)pg/ml,对il-23分泌也未有明显影响;在lps刺激的同时加入1,25-二羟维生素d3处理的dcs低分泌il-10(92.72±15.06)pg/ml,tgf-β(734.44±57.58)pg/ml略有降低、il-23(4.19±1.20)pg/ml分泌未有明显影响。细胞因子也会影响t细胞向不同t辅助细胞分化,il-23和tgf-β在th17细胞分化的起始、稳定和维持阶段都发挥重要作用,il-10在treg分化中也有重要作用。结果表明1,25-二羟维生素d3和地塞米松都可以抑制dcs分泌il-10和tgf-β,对dcs分泌il-23无影响,提示1,25-二羟维生素d3和地塞米松可能通过il-10和tgf-β影响th17与treg分化与功能。第二部分:1,25-二羟维生素d3及lps处理ova致敏小鼠脾脏dcs在共培养中对t细胞分化的影响1.流式细胞技术检测共培养细胞中各辅助性t细胞比例与对照组相比较,lps处理后的dcs可以刺激t细胞向cd4+ifn-γ+(8.93±2.18vs15.77±2.23)、cd4+il-4+(9.32±2.36vs12.6±1.07)、cd4+il-17a+(9.27±1.35vs16.06±1.83)、cd4+cd25+foxp3(16.4±1.57vs10.93±1.43)分化(p均小于0.05)。1,25-二羟维生素d3处理后,和对照组比较,也可以使t细胞向cd4+ifn-γ+(17.33±2.32vs8.93±2.18)、cd4+il-4+(13.62±1.38vs9.32±2.36)分化(p均小于0.05)。和lps组比较,1,25-二羟维生素d3处理的dcs可以抑制由lps引起的il-17a(7.61±1.72vs16.06±1.83)分化(p0.05)。地塞米松处理dcs与lps组比较,地塞米松可以抑制由lps引起的cd4+ifn-γ+(8.93±1.13vs15.77±2.23)、cd4+il-4+(7.10±0.81vs12.6±1.07)、cd4+il-17a+(8.86±0.96vs16.06±1.83)、cd4+cd25+foxp3(9.46±0.85vs16.4±1.57)分化(p均小于0.05)。这表明地塞米松可以抑制由lps引起各辅助t细胞分化,1,25-二羟维生素d3促进th1细胞和th2细胞分化,抑制th17细胞分化。2.elisa检测共培养上清液中细胞因子lps处理后与对照组比较细胞上清液中il-17a(12.01±2.2vs4.46±0.11)、il-4(2.5±0.14vs1.66±0.12)分泌升高(p均小于0.05)。1,25-二羟维生素d3处理后与lps组比较,il-17a(3.11±0.25vs12.01±2.2)分泌下降(p0.05),il-4(3.15±0.3vs2.5±0.14)分泌上升(p0.05)。加入地塞米松与lps组比较,il-17a(3.89±0.75vs12.01±2.2)、il-4(1.3±0.24vs2.5±0.14)、ifn-γ(0.56±0.2vs1.88±0.57)分泌均下降(p均小于0.05)。ifn-γ、il-4和il-17a分别是th1、th2和th17细胞的重要效应因子,结果显示lps可以促进t辅助细胞分泌ifn-γ、il-4和il-17a,进一步发挥t辅助细胞效应。地塞米松处理抑制细胞分泌其细胞因子,而1,25-二羟维生素d3可以促进il-4分泌,抑制il-17a分泌。第三部分:1,25-二羟维生素d3及lps处理ova致敏小鼠脾脏树突状细胞表达的detal-like4配体对th17细胞分化的影响1.流式细胞技术检测共培养细胞中各辅助性t细胞比例在共培养期间加入detal-like4阻断抗体后,lps处理后的dcs与对照组相比不能使t细胞向cd4+il-17a+分化(9.4±1.41vs10.03±0.73),同时加入1,25-二羟维生素d3或者地塞米松处理后和lps组比较未有进一步下降(8.96±0.22,9.36±0.67vs9.4±1.41)。与阻断detal-like4前比较,lps组在阻断后cd4+il-17a+分化下降(16.06±1.83vs9.4±1.41)(p0.05)。阻断detal-like4后,treg在对照组、lps组、lps+dex组和lps+vitd3组各组间差异表达与阻断前各组间差异表达趋势一致。这表示阻断detal-like4配体后,抑制了th17分化,但不影响treg分化;阻断detal-like4配体可以抑制1,25-二羟维生素d3对th17细胞分化调节。2.elisa检测共培养上清液中细胞因子阻断detal-like4后的共培养上清液il-17a,lps+dex组与对照组、lps组比较有下降(1.50±0.36vs3.08±0.5,3.33±0.17)(p均小于0.05),而lps+vitd3组与对照组、lps组比较无明显降低(3.47±0.63vs3.08±0.5,3.33±0.17)。这表明阻断detal-like4后可以抑制1,25-二羟维生素d3对il-17a的调控,而不能完全抑制地塞米松对il-17a的调控。研究结论与研究意义1.致敏小鼠分离出的脾脏dcs都处于较成熟状态,而lps、地塞米松或者1,25-二羟维生素d3处理24小时不影响这种成熟状态。相较地塞米松,1,25-二羟维生素d3对notch配体的影响更显著,这可能提示1,25-二羟维生素d3能显著通过notch信号通路影响t辅助细胞的分化。2.lps处理dcs可以刺激t细胞向th17与treg分化,地塞米松处理dcs,可以抑制由lps引起辅助细胞分化,但不影响th17/treg平衡。1,25-二羟维生素d3处理dcs,能够抑制由lps引起的th17细胞分化,而对lps引起的treg细胞分化无明显影响,有利于th17/treg平衡。3.1,25-二羟维生素d3对th17分化和功能的抑制主要是通过下调dcs表达的notch配体detal-like4,而阻断detal-like4不影响treg细胞分化,因此阻断detal-like4可以有利于th17/treg平衡。地塞米松同时抑制th17细胞和treg细胞分化,但这种调控不单是通过detal-like4配体。detal-like4在1,25-二羟维生素d3抑制th17分化中发挥重要作用,进一步表明detal-like4在dcs介导的th17分化中的作用。在体外阻断detal-like4可以有利于恢复th17/treg平衡,为今后设计阻断detal-like4的dcs治疗哮喘提供新的思路。树突状细胞notch信号在1,25-二羟维生素d3调节th17
【关键词】：
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R562.25
【目录】：

• 缩略语表5-7
• 英文摘要7-15
• 中文摘要15-23
• 前言23-26
• 第一章 1,25-二羟维生素D3对LPS处理的OVA致敏的小鼠脾脏树突状细胞表型的影响26-57
• 1.1 材料与方法26-40
• 1.2 结果40-55
• 1.3 讨论55-56
• 1.4 小结56-57
• 第二章 1,25-二羟维生素D3及LPS处理OVA致敏小鼠脾脏树突状细胞在共培养中对T细胞分化的影响57-73
• 2.1 材料与方法57-62
• 2.2 结果62-70
• 2.3 讨论70-72
• 2.4 小结72-73
• 第三章 1,25-二羟维生素D3及LPS处理OVA致敏小鼠 脾脏树突状细胞表达的Detal-like4配体对Th17细胞分化的影响73-87
• 3.1 材料与方法73-78
• 3.2 结果78-83
• 3.3 讨论83-85
• 3.4 小结85-87
• 全文结论87-88
• 参考文献88-93
• 文献综述Notch信号通路在CD4+ T辅助细胞分化中的作用93-107
• 参考文献102-107
• 攻读博士期间发表的文章107-108
• 致谢108-109

【参考文献】

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1 朱安友;吕合作;张伦军;胡建国;王凤超;李柏青;;结核分枝杆菌耐热抗原激活的人γδT细胞Th2极性分化特征以及T-bet/GATA-3对分化的调控作用[J];细胞与分子免疫学杂志;2015年01期

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本文编号：309878