白细胞介素-21在乙型肝炎病毒感染中的作用研究

发布时间：2017-04-15 21:12

  本文关键词：白细胞介素-21在乙型肝炎病毒感染中的作用研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景和目的:宿主的免疫功能在HBV的清除中起着至关重要的作用,急性HBV感染病毒能否彻底清除与宿主感染时年龄密切相关。近年的研究表明,在HBV感染的情况下,某些细胞因子、趋化因子可以招募活化的免疫细胞,如T细胞、B细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等,由外周血循环向肝脏聚集,在介导宿主先天性、适应性免疫反应及HBV的清除过程中起着非常重要的作用。由此可见,细胞因子的表达水平在抗病毒效果及疾病结局中起着关键的作用。研究表明HBV特异性CD8+T细胞可以通过细胞毒机制及非细胞毒机制抑制HBV的复制,由细胞因子介导的非细胞毒机制在下调HBV复制的过程中起着决定性的作用。在急性HBV感染早期活化的NK细胞、NKT细胞可以分泌大量的IFN-γ,在限制疾病进展中发挥着非常重要的作用。在HBV感染建立后,CD8+T细胞分泌的IFN-γ、TNF-α介导的非细胞毒机制在HBV清除中起着关键的作用。在肝内,IFN-γ可以激活KCs表面IFN-γ受体的表达,在先天性及获得性免疫反应中起着非常重要的作用。TNF-α是HBV清除的关键细胞因子,肝内TNF-α水平增高可以增强CD8+T对HBV的应答,导致对HBV感染的肝细胞清除病毒增强。TNF-α还可以通过刺激HBV特异性细胞毒T细胞、加速HBV m RNA的降解促进HBV病毒的清除。IL-10作为抑制性细胞因子在病毒感染的建立、持续及T细胞耗竭等过程中起着关键的作用。慢性乙肝患者体内IL-10表达增加是HBV持续感染的主要因素。急性乙肝患者体内IL-10分泌增加,激活的NK细胞分泌IFN-γ的能力下降,HBV特异性CD4、CD8 T细胞应答减弱。封闭IL-10受体的策略可以恢复HBV特异性CD8+T细胞的应答,加速病毒的清除,有利于慢性HBV感染的控制。IL-21可以促进CD4+T辅助细胞的功能,改善CD8+T细胞功能的耗竭状态及免疫应答,并且可以增加TNF-α、IFN-γ的分泌,在慢性病毒感染的控制中起着非常重要的作用。慢性乙肝患者体内IL-21水平降低可能与HBV持续感染关系密切。IL-21在年龄相关的HBV感染慢性化中亦起着非常重要的作用。综上所述,HBV感染过程中,IL-21可能通过调节免疫细胞分泌细胞因子及改善免疫应答在HBV感染的控制中起着非常重要的作用。我们通过建立pbmcs与huh7.93细胞共培养体系,来模拟hbv感染后肝脏微环境及机体的免疫功能状态,为研究hbv感染的免疫清除机制提供可行的体外培养系统。并利用这个共培养体系来研究体外培养条件下il-21抑制hbv复制的机制,同时研究il-21与相关细胞因子之间的关系及对hbv复制的影响,为研究hbv感染免疫清除机制提供新的方法,为il-21在控制hbv感染中的重要作用提供新的证据,为hbv感染的控制提供新的思路。方法:第一部分:pbmcs与huh7.93细胞共培养体系的建立本部分内容分别采用健康志愿者的pbmcs和慢性乙肝患者的pbmcs与huh7.93细胞系共培养,观察细胞因子ifn-γ、tnf-α、il-21、il-10的变化及hbv复制的情况,探讨细胞因子与hbv复制的关系。第二部分:白细胞介素-21体外抑制乙型肝炎病毒的作用研究我们观察了不同浓度的il-21、il-10刺激huh7.93细胞后huh7.93细胞分泌hbv的情况,研究体外培养条件下il-21、il-10对hbv复制的直接影响。同时利用我们建立的huh7.93细胞与cpbmcs共培养体系,观察了il-21刺激共培养的细胞后,hbv复制情况及细胞因子的变化情况,研究共培养条件下il-21对hbv复制的影响。第三部分:白细胞介素-21与慢性乙肝患者疾病关系研究鉴于细胞因子在慢性hbv感染中的重要作用,本部分内容检测慢性乙肝患者外周血中il-21、il-10、ifn-γ、tnf-ɑ细胞因子的水平,测定患者外周血中病毒成分hbvdna定量、hbeag定量、hbsab定量,测定患者肝脏炎症程度的指标alt、ast。通过对上述指标的分析,及细胞因子与病毒复制指标、肝脏炎症指标的关系来探讨细胞因子ifn-γ、tnf-ɑ、il-21、il-10在慢性hbv感染中的作用。结果:第一部分:pbmcs与huh7.93细胞共培养体系的建立我们的结果显示npbmcs单独培养与cpbmcs单独培养时,cpbmcs分泌ifn-γ较npbmcs分泌有所降低,cpbmcs分泌il-10较npbmcs分泌有所增高,但是两者分泌细胞因子ifn-γ、tnf-ɑ、il-10、il-21比较均无统计学差异。huh7.93细胞与npbmcs及cpbmcs共培养后,细胞培养上清液中hbvdna定量、hbeag定量、hbsag定量均明显增加。共培养细胞裂解液中hbv复制中间体较huh7.93细胞单独培养时明显增多。共培养后细胞因子测定结果显示,cpbmcs产生的il-21、fn-γ较nPBMCs产生的明显减少。相关分析表明,Huh7.93细胞与nPBMCs共培养细胞培养上清液中FN-γ、TNF-α水平与IL-21水平呈正相关,而与c PBMCs共培养时无相关性。第二部分:白细胞介素-21体外抑制乙型肝炎病毒的作用研究应用不同浓度IL-21刺激Huh7.93细胞后细胞培养上清液中HBV DNA定量及细胞培养裂解液中HBV复制中间体均随着IL-21的浓度增加逐渐降低。应用不同浓度的IL-10刺激Huh7.93细胞后结果提示低剂量的IL-10能明显促进Hhh7.93细胞中HBV的复制。应用IL-21刺激Huh7.93细胞与c PBMCs共培养体系后,细胞培养上清液中HBs Ag、HBe Ag、HBV DNA定量明显下降,细胞裂解液中HBV复制中间体亦明显减少。应用IL-21刺激后,细胞培养上清液中IL-10的水平与未刺激组比较明显下降。相关分析表明应用IL-21刺激共培养细胞后,细胞培养上清液中HBV DNA水平与IL-21及IFN-γ呈正相关。第三部分:白细胞介素-21与慢性乙肝患者疾病关系研究我们的研究显示,重度慢性乙肝患者血清中IL-10及ALT、AST水平较轻中度慢性乙肝患者明显增高。相关分析表明,HBV DNA定量水平与IL-21、IFN-γ水平呈负相关,HBeAg定量水平与IL-21水平亦呈负相关,TNF-ɑ水平与ALT水平呈正相关。结论:(1)本研究在国内外相关研究的基础上,采用Huh7.93细胞系与PBMCs共培养来模拟HBV感染后人体肝脏微环境及免疫功能状态,发现PBMCs可以明显促进Huh7.93细胞系中HBV的复制,在国内外首次成功地建立了一个简单可靠的细胞共培养体系,为研究HBV感染免疫清除机制提供了新的方法,具有重要的实用价值。(2)本研究利用这个共培养体系,我们研究了体外培养条件下IL-21抑制HBV复制的机制。明确了IL-21可以直接抑制体外培养条件下HBV的复制,同时发现IL-21可以通过下调IL-10的分泌起到抑制HBV复制的目的,为细胞因子间相互作用在调节HBV复制中的重要作用提供了直接的证据。另外我们还发现IL-10可以明显促进体外培养条件下HBV的复制,为IL-10在维持HBV感染中的关键作用提供了可靠的依据。(3)为了证实IL-21在慢性乙肝患者体内对HBV复制的影响,我们观察了慢性乙肝患者血清中IL-21与HBV复制的关系。我们发现IL-21与HBV DNA、HBeAg的水平呈负相关,揭示了IL-21分泌不足是慢性乙肝患者体内HBV持续的重要因素。
【关键词】：白细胞介素-21 白细胞介素-10 Huh7.93细胞系 外周血单个核细胞 细胞因子
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R512.62
【目录】：

• 缩略语表4-6
• 英文摘要6-10
• 中文摘要10-13
• 第一章 前言13-17
• 第二章 外周血单个核细胞与Huh7.93细胞共培养体系的建立17-41
• 2.1 材料和方法18-32
• 2.2 结果32-37
• 2.3 讨论37-41
• 第三章 白细胞介素-21体外抑制乙型肝炎病毒的作用研究41-49
• 3.1 材料和方法41-43
• 3.2 结果43-47
• 3.3 讨论47-49
• 第四章 白细胞介素-21与慢性乙肝患者疾病关系研究49-57
• 4.1 材料和方法50-52
• 4.2 结果52-54
• 4.3 讨论54-57
• 全文结论57
• 总结和展望57-58
• 参考文献58-70
• 文献综述 细胞因子与乙型肝炎病毒感染的研究进展70-95
• 参考文献81-95
• 博士在读期间发表的文章95-96
• 致谢96

【参考文献】

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1 姜荣龙 ,冯筱榕 ,郭亚兵 ,卢桥生 ,侯金林 ,骆抗先 ,富宁;T helper cells in patients with chronic hepatitis B virus infection[J];Chinese Medical Journal;2002年03期

2 ;Polymorphisms of some cytokines and chronic hepatitis B and C virus infection[J];World Journal of Gastroenterology;2009年44期

  本文关键词：白细胞介素-21在乙型肝炎病毒感染中的作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：309260