长链非编码RNA DARS-AS1及孟鲁司特钠在多发性骨髓瘤内作用机制的相关研究

发布时间：2021-03-27 11:00

　　多发性骨髓瘤（MM）的疾病特点为是骨髓浆细胞在低氧骨髓微环境中恶性增殖,其具有高度异质的遗传背景和临床表现,预后差。长链非编码RNA（lncRNA）是一类不编码蛋白,长度大于200nt的RNA分子。lncRNA可参与染色质修饰,转录激活,核内运输等多种生理过程。既往研究报道,低氧相关的lncRNA可参与缺氧/HIF-1相关的癌症进展。低氧微环境对MM的发生、发展、耐药及复发至关重要,所以我们使用RNA高通量测序分析在低氧培养条件下,骨髓瘤细胞系U266内差异表达的lncRNA分子。我们发现HIF-1α可促进骨髓瘤细胞系内lncRNA DARS-AS1的转录。体内及体外实验均证明,DARS-AS1过表达可促进骨髓瘤细胞增殖并抑制细胞凋亡,敲除DARS-AS1可抑制骨髓瘤细胞增殖并促进其凋亡。通过RNA-Pulldown联合蛋白质质谱分析的方法,我们检测到RBM39为DARS-AS1的靶蛋白。过表达RBM39可以部分恢复敲除DARS-AS1后的细胞表型。我们推断DARS-AS1可能通过影响RBM39的表达水平而发挥其生物学功能。进一步研究表明,DARS-AS1可以减弱RBM39与E3泛素连... 

【文章来源】：上海交通大学上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

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长链非编码RNA的作用机制

上海交通大学医学院博士学位论文22在分析细胞转录组及其表达水平中的应用十分广泛。我们利用此技术对U266细胞的转录组进行高通量测序，来寻找受低氧调控的lncRNA。得到相关的数据后，我们进行下一步的验证，首先要设置的筛选条件是RPKM值大于10，即lncRNA在细胞中的表达要易于检测。调变的lncRNA，我们设置的筛选条件是差异倍数大于4（低氧/常氧≥4或者低氧/常氧0.25）。符合以上两个条件的lncRNA共有77个。然后，从上述调变的lncRNA对其设计qRT-PCR引物并进行验证。其中有30个lncRNA可以qRT-PCR引物设计，并从引物的熔解曲线、PCR的扩增曲线以及PCR产物的特异性三个方面对检测效率进行了评估，最终我们成功鉴定了22个lncRNA（见图1）。具体鉴定方法如下：将1106个U266细胞系置于低氧环境中（氧浓度1%）放置24小时，同时设置常氧下培养的U266细胞系作为对照。提取U266细胞中RNA，使用Q-PCR的方法对lncRNA的表达差异进行检测。结果提示MIR210HG与DARS-AS1在低氧培养条件下，明显升高。图1.U266细胞内的lncRNAs的鉴定Figure1.InvivoidentificationoflncRNAsinU266cellline2.2表达调变的lncRNA的生物学功能筛选简述一下功能筛选的方法。首先，针对lncRNA设计shRNA片段，将其转染到MM细胞系中，然后利用qRT-PCR检测其敲减效率。因为低氧环境对骨髓瘤的增殖、凋亡影响较多，因此，我们选择细胞增殖及凋亡实验作为主要的功能筛选实验。

上海交通大学医学院博士学位论文23MIR210HGshRNA敲除效率如图2A，可见shRNA敲除效率可达50%以上。但敲除MIR210HG对细胞的增殖及凋亡无明显影响（图2B-D）图2.lncRNAMIR210HG的生物学功能验证Figure2.BiologicalfunctionalstudyoflncRNAMIR210HG（A）qRT-PCR检测MIR210HG在骨髓瘤细胞中的敲除效率。（B-C）MIR210HG敲除后，CCK-8检测细胞增殖速率检测。（D）AnnexinV/PI双染细胞后，使用流式细胞技术检测细胞凋亡。我们检测了DARS-AS1在多种MM细胞系中的表达，发现多种骨髓瘤细胞系中DARS-AS1均可以在低氧培养条件下高表达（如图3A）。同时将正常供者的单个核细胞与MM患者骨髓内CD138+的浆细胞同时放置在低氧环境（1%低氧）中，处理24h。骨髓瘤患者CD138+的浆细胞内的DARS-AS1升高倍数明显高于正常供者（如图3B）。


本文编号：3103393